Undersøgelse af Makrofag Polarization Brug knoglemarvsafledte makrofager
Summary
I artiklen beskrives en let let adaptiv<em> In vitro</em> Model til at undersøge makrofag polarisering. I nærvær af GM-CSF/M-CSF er hæmatopoietiske stamceller / stamceller fra knoglemarven ledes ind monocytær differentiering, efterfulgt af M1 eller M2 stimulation. Aktiveringen status kan spores af ændringer i celleoverfladeantigener, genekspression og celle signalveje.
Abstract
I artiklen beskrives en let let adaptiv in vitro-model til at undersøge makrofag polarisering. I nærvær af GM-CSF/M-CSF er hæmatopoietiske stamceller / stamceller fra knoglemarven ledes ind monocytær differentiering, efterfulgt af M1 eller M2 stimulation. Aktiveringen status kan spores af ændringer i celleoverfladeantigener, genekspression og celle signalveje.
Introduction
Adskilt fra klassiske inflammatoriske reaktioner, makrofager, der infiltrerer væv udviser ofte polariseret aktivering status, spiller en afgørende rolle i reguleringen af værtsvæv fysiologiske funktioner 1-8. Ved stimulering, kan makrofagaktivering sorteres i klassisk (M1) og alternativ (M2) aktivering 2, 4, 9. M1 makrofagaktivering afhænger Toll-lignende receptorer (TLRs) og aktivering af nuklear faktor kappa B (NFKB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (Jnk1), hvilket fører til produktion af inflammatoriske cytokiner, såsom TNF-α og IL- 1β og aktivering af iNOS, som resulterer i øget produktion af reaktive ilt arter såsom nitrid-oxid (NO) 10, 11. I modsætning hertil fører M2 makrofagaktivering rekrutter PPARy, PPARδ eller IL-4-Stat6 veje, til alternativ, anti-inflammatorisk (M2) aktivering, som er forbundet med opregulering af mannosereceptoren CD206, og arginase 1 (arg1) 6, 12 – 14 </ Sup>.
Knoglemarv afledte makrofager (BMDM) udgør en ideel in vitro-model til at forstå de mekanismer, der styrer polarisering af aktiverede makrofager 15. Specifikt kan aktivering af M1 makrofager induceres af lipopolysaccharider (LPS) stimulering, mens polarisering af M2 makrofager kan induceres af IL-4 og / eller IL-13. Modne knoglemarv afledt makrofager og aktiverede makrofager kan identificeres gennem flowcytometrianalyse for ekspression af overflade-antigener, herunder CD11, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 og CD86 9, 16, 17. Desuden kan ændringer i cytokinproduktion og celle signalveje forbundet med makrofag polarisering måles ved kvantitativ RT-PCR og western blotting, hhv. Sammenfattende kan mus knoglemarv afledte makrofager tjene som en relevant model til at studere makrofag polarisering in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer her en enkel og let tilpasses in vitro procedure til at inducere aktivering af makrofager afledt af knoglemarven. Denne procedure kan anvendes til undersøgelse af mekanismerne bag polarisering af makrofager. Renheden af modne makrofager opnået ved hjælp af denne protokol gennemsnit 95-99%, og ingen yderligere rensning procedurer er påkrævet. At undersøge funktionen af specifikke gener af interesse i forbindelse med makrofag polarisering, ektopisk udtryk eller genspecifik knockdo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (BGIA 7.850.037 til Dr. Beiyan Zhou).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
