Injection stéréotaxique d'un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris
Summary
Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l'expression génique conditionnelle ou l'ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.
Abstract
Injection intra-parenchymateux d'un vecteur viral permet la manipulation génétique conditionnel populations distinctes de neurones ou des régions particulières du système nerveux central. Nous démontrons une technique d'injection stéréotaxique qui permet l'expression du gène ciblé ou le silence dans la corne dorsale de la moelle épinière de souris. L'intervention chirurgicale est de courte durée. Il nécessite laminectomie d'une vertèbre unique, offrant pour la récupération rapide de l'animal et de la motilité intacte de la colonne vertébrale. Injection contrôlée d'un volume de suspension petit vecteur à faible vitesse et à l'utilisation d'une micro-canule avec verre biseauté minimiser la lésion tissulaire. La réponse immunitaire locale au vecteur dépend des propriétés intrinsèques du virus utilisé, dans notre expérience, il est mineure et de courte durée quand une adéno-associé recombinant virus est utilisé. Un gène rapporteur tel que le renforcement de la protéine fluorescente verte facilite la distribution spatiale de surveillance du vecteur, et l'efficacité et cellulaire spécificité de la transfection.
Introduction
Les technologies de pointe de la manipulation génétique conditionnelle chez la souris permettent des approches multidimensionnelles à l'exploration des voies synaptiques et les connexions fonctionnelles dans le système nerveux central. Transgènes peut être régulée par petites molécules effectrices telles que la doxycycline agissant sur un transactivateur de tétracycline contrôlée, qui peut être conçu pour fonctionner comme un répresseur ou un activateur de la transcription du gène, ou le tamoxifène reconnaître une mutation de domaine de liaison au ligand du récepteur oestrogène 1 . Modification irréversible transgène est généralement obtenue par l'acide désoxyribonucléique (ADN) recombinases. Cre (recombinaison causes) et Flp (enzyme de recombinaison flippase) catalyser l'excision, inversion ou translocation de fragments d'ADN qui sont flanquées par loxP (lieu de passage sur x, P1) ou Frt (cible de reconnaissance flippase) sites, respectivement 1. Les applications incluent l'activation de gènes ou le silence et l'acide inductible ribonucléique (ARN) des interférences <sup> 2. Expression conditionnelle de reporters fluorescents ou enzymatiques tels que β-galactosidase ou la phosphatase alcaline peut être utilisée pour étiqueter les neurones et d'examiner leur organisation locale et la connectivité 3. Projets de mutagenèse à grande échelle en Amérique du Nord ( http://www.norcomm.org/index.htm ) et en Europe ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) produisent des bibliothèques de clones embryonnaires de souris de cellules souches avec gènes cibles conditionnelles et les pièges qui finira par couvrir l'ensemble du génome de la souris. Les souris issues de ces clones peuvent être croisés avec un nombre croissant de lignées de souris qui expriment recombinases ADN dans des promoteurs ou des loci spécifiques à une population particulière de neurones pour la manipulation génétique sélective ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> Cependant, restreindre la manipulation génétique de populations distinctes de neurones ou des régions particulières d'intérêt ne peut pas être atteint par ciblage génétique seul si un promoteur spécifique à la population de neurones d'intérêt n'est pas connu ou ne s'exprime pas par tous les neurones de la région d'intérêt. Dans la moelle épinière, des modèles expérimentaux peuvent nécessiter restriction spatiale de la manipulation génétique d'une ou deux segments craniocaudale. Injection stéréotaxique d'un vecteur viral exprimant Cre ou FLP permet de limiter la recombinaison de gènes de régions dans la moelle épinière de souris dans lequel les fragments d'ADN flanqués de sites FRT ou loxP, que l'on appelle allèles floxé ou flrted. Contrairement réarrangement de l'ADN constitutive, qui résulterait de croisements avec des animaux recombinase souris exprimant, cette stratégie permet également de contrôler temporelle sur l'activation de gènes ou le silence. Les vecteurs viraux codant pour floxé ou flirté transgènes offrir une option inverse de la manipulation génétique chez les souris exprimant le corresponding en aval d'un promoteur recombinase spécifique des neurones. Plusieurs vecteurs recombinants ayant une affinité pour les neurones sont disponibles 4. Haute capacité (lâche) adénovirus, virus adéno-associé, l'herpès simplex virus et lentivirus sont couramment utilisés vecteurs neurotropes. Sélection du virus approprié pour une question de recherche est un élément essentiel de la conception expérimentale. Taille du transgène, l'itinéraire de livraison, la spécificité de l'infection des neurones par opposition aux cellules gliales, l'efficacité, l'infection effets secondaires inflammatoires et toxiques doivent être considérées 4.Nous décrivons ici l'injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale de la moelle épinière, une technique que nous employons pour la régulation des gènes avec sursis dans notre recherche sur la neurobiologie de la douleur. La corne dorsale reçoit influx afférents primaires de neurones somatosensoriels y compris les neurones nociceptifs. Interneurones locaux traiter l'information avant de la transmettre neurones de projection dela corne dorsale du cerveau 5. On démontre l'infection des neurones de la corne dorsale de la colonne vertébrale segmentaire niveau L4 avec un neurotrope recombinant virus adéno-associé (rAAV) qui exprime la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur du cytomégalovirus constitutivement actif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injection stéréotaxique vecteur de ciblage permet neurones de la moelle épinière pour des applications telles que la cartographie du réseau neuronal sur la base de virus d'étalement transsynaptique 6,7 ou 8 optogenetic dissection, guidage axonal pendant la régénération de lésions 9,10, la thérapie génique ou pour la prévention ou le traitement de la neurodégénérescence 11, 12. Les vecteurs viraux ont été utilisés pour la manipulation génétique dans la …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur du développement et de la production Vector dans la Neuroscience Center du Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, pour nous avoir fourni le vecteur rAAV-EGFP, et John Whang pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par une bourse R01 NS050408 (JS) de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
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