Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Analisi di espressione genica dei tessuti eterogenei è sempre stato problematico,. Ciò è particolarmente vero nel cervello dei mammiferi, che ha circa 5.000 diversi tipi di cellule ⁴ Prima dello sviluppo della cattura microdissezione laser (LCM) tecnica, studi genomici degli effetti di TBI in vivo erano basate su analisi di espressione genica in una popolazione mista di cellule cerebrali compresi, non solo di differenti tipi di cellule neuronali, ma anche di supportare cellule gliali e immunomodulatori. I relativi complessi profili di espressione genica ottenuti da questi tessuti eterogenei, e gli schemi spesso conflittuali di segnali cellulari lesioni indotte, può essere una spiegazione del fallimento nel corso degli studi clinici di strategie terapeutiche dimostrato efficace in studi pre-clinici di trauma cranico. ⁵

Per ottenere una chiara comprensione di lesione indotta l'espressione del gene in popolazioni vulnerabili di neuroni dal fianco rattopocampus, abbiamo adottato la tecnica della LCM, la prima volta da Emmert-Buck et al. ³ Successivamente, abbiamo modificato e ottimizzato questa tecnica per la cattura microdissezione efficiente delle popolazioni arricchite di neuroni e neuroni singoli per il profiling mRNA utilizzando quantitativa PCR in tempo reale e l'analisi microarray . Per mantenere l'integrità del mRNA in sezioni congelate di tessuto cerebrale per analisi genomica, abbiamo modificato protocolli esistenti per il fissaggio, colorazione e acquisizione rapida dei neuroni da sezioni congelate di cervello di ratto. Per l'identificazione e l'isolamento dei neuroni ippocampali feriti e moribondi, abbiamo anche ottimizzato il Fluoro-Jade tecnica di pittura per LCM. Fluoro-Jade non distingue tra la morte cellulare per apoptosi e necrosi. Così, tutti i tipi di neuroni in degenerazione può essere rilevato da questa macchia. ^6,7

Qui, descriviamo il protocollo utilizzato nel nostro laboratorio per ottenere pool di singoli neuroni morenti o di reversibilità, nonché di andane arricchito populaticomponenti di diversi tipi di cellule neuronali (cioè CA1-CA3 neuroni per l'analisi di espressione genica dopo TBI). La procedura per lesioni fluido cerebrale percussioni eseguite nel nostro laboratorio è descritto in dettaglio in Shimamura et al., ⁸ ed è molto simile al fluido laterale-percussioni protocollo pregiudizio per topi pubblicati JoVE da Alder et al. ⁹ Poiché la tecnica LCM ha dimostrato di avere un effetto minimo o nullo sulla integrità del DNA, RNA e proteine ​​nei tessuti, questo è un ottimo strumento per l'analisi molecolare e proteine ​​di tipi cellulari definiti.

1. Procedure chirurgiche e Percussioni Fluid TBI

1. Tutti gli esperimenti sugli animali vengono prima approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e il National Institutes of Health Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (8 ° Edizione, Consiglio Nazionale delle Ricerche).
2. I ratti (maschi adulti Sprague-Dawley, 400-500 gr ottenuto dal fornitore Rivers Charles, Portland, Maine) sono alloggiati due per gabbia e ha fornito cibo e acqua ad libitum in un vivaio con queste condizioni costanti: ciclo di luce (600 ore a 1.800 hr), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e umidità (40% al 50%) una settimana prima dell'uso.
3. Anestetizzare ratti con il 4% isoflurano, intubate, e meccanicamente ventilare (NEMI scientifico, New England Medical Instruments, Medway, MA) i ratti con 1,5-2,0% isoflurano in ossigeno: aria (70:30) e li prepara per parasagittale fluido percussioni lesioni, come precedentemente descritto. ⁸, 10
4. Sacrificare ratti al punto di tempo appropriato dopo lesione seconda del disegno sperimentale. Rimuovere rapidamente il cervello, congelare immediatamente in ghiaccio secco, e conservare a -80 ° C in un tubo da 50 ml o procedere immediatamente da incorporare nel PTOM per sezionamento congelati.

2. Sezionamento e colorazione di cervello di ratto

1. Tessuto cerebrale che non viene utilizzato immediatamente possono essere conservati a -80 ° C fino ad un mese se mantenuta ad una temperatura costante. I cervelli che vengono congelati a -80 ° C, poi scongelati a -20 ° C per il sezionamento, e poi ri-congelati non danno RNA di qualità dopo lo scongelamento secondo. Una volta che il cervello è scongelato, montato in OCT e sezionata, vetrini devono essere colorati entro 24 ore e utilizzati per LCM entro 30 minuti ad un'ora di colorazione. Ciò garantirà RNA di buona qualità. A seguito di LCM, cellule catturate su tappi LCM possono essere memorizzati in un tampone di lisi a -80 ° C per un massimo di una settimana, ma l'RNA devono essere isolati in modo tempestivo per garantire la massima qualità. </ Li>
2. Prima di sezionare il cervello, pulire il criostato con RNasi-Zap e pulire le spazzole con EtOH (sostituire la lama usa e getta tra ogni cervello).
3. Recuperare il cervello nel tubo 50 ml dal congelatore a -80 ° C; posizionarlo nel criostato ad una temperatura di -22 ° C e scongelare nel tubo per circa 10 min. Rimuovere il cervello dal tubo e il luogo sul palco su garza, lato ventrale in alto.
4. Usando una lama di rasoio, la fetta di cervello per rimuovere la parte posteriore del cervello appena rostrale al cervelletto e la porzione anteriore al chiasma ottico. Riempire un cryomold con il mezzo di montaggio ottobre (Tissue Tek), e inserire il cervello nello stampo con la parte anteriore verso il basso. Lasciare che il tessuto cerebrale di congelare nel liquido di montaggio fino a che non diventa bianco (circa 10 min).
5. Congelare il disco di preparato (Tissue Tek) sul cervello con ottobre Rimuovere il cervello dallo stampo. Inserire il cervello nella testa del preparato e serrare le viti.
6. Inserire un Disposabile, lama a basso profilo (Fisher Scientific) nel porta-lama e serrare la leva verso il basso.
7. Iniziare il taglio del cervello a 20 micron per rimuovere lo strato esterno di ottobre Una volta che la regione ippocampale è raggiunta, posizionare il selettore a 10 micron. Raccogliere coronali sezioni seriali mettendo un vetrino o plus-vetrini sulla sezione di tessuto (Fisher Scientific). Vetrini vengono conservati a -20 ° C in un RNase-free cremagliera colorazione fino sezionamento è completa.
8. Per rimuovere tutte le RNasi dal vetro in cui sono trattati sezioni di tessuto, pulire tutti i contenitori di colorazione e cilindri graduati con ELIMINase (Fisher Scientific) e sciacquare con acqua Milli-Q. Preparare tutte le soluzioni con acqua priva di RNasi e filtrare il violetto cresolo (Sigma-Aldrich) e Fluoro-Jade (Histo-chem) macchia con un 0,2 micron filtro prima dell'uso.
9. Scongelare sezioni di cervello a temperatura ambiente per 30 sec e fissare in% ETOH 75 (1 min).
10. Per LCM di singoli neuroni danneggiati dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua RNase-free (1 min), Di contrasto con 1% di violetto cresolo (15-20 sec), sciacquare in acqua priva di RNasi (2 × 30 sec), macchia con Fluoro-Jade (4 min), sciacquare in acqua priva di RNasi (3 × 1 min), Disidratare con 95% EtOH fatto da acqua priva di RNasi (30 sec), 100% EtOH (30 sec), e xilene (2 × 3 min).
11. Per LCM di andane di neuroni dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua RNase-free (1 min), macchia con 1% di violetto cresolo (1 min), sciacquare in acqua priva di RNasi per (3 × 1 min), disidratazione con il 95% ETOH (2 × 30 sec), 100% EtOH (2 × 30 sec), e xilene (2 × 3 min).
12. Asciugare tutte le sezioni in una cappa di aspirazione per 15 minuti prima di LCM. I vetrini possono essere conservati, i lati di sezione fino, in una scatola rivestita di disseccante, se hanno bisogno di essere trasferiti da una stanza all'altra. Tuttavia, i migliori risultati si ottengono se LCM viene eseguito immediatamente dopo sezioni sono secche. LCM dovrebbe essere limitata da 30 minuti a 1 ora. Nella prossima sezione, si descrive prima come catturare andane continue di cellule, che è eaSiest da padroneggiare per coloro che stanno imparando questa tecnica. Poi si descrive come catturare con precisione singoli neuroni. Nella nostra procedura, identifichiamo i neuroni che muoiono per la loro affinità per Fluoro-Jade-un marcatore di neuroni in degenerazione. Cellule Fluoro-Jade-negativi si presume essere sopravvissuto neuroni.

3. Microdissezione Laser Capture (LCM)

LCM di andane di popolazioni arricchite di neuroni ippocampali

1. LCM viene eseguita utilizzando un microscopio PixCell IIe con un laser a diodo ad infrarossi (Life Technologies).
2. Regolare il joystick al centro in posizione verticale. Ruotare e bloccare l'obiettivo 4X in posizione.
3. Collocare una diapositiva al centro del portaoggetti e regolare manualmente fino alla regione dell'ippocampo è in vista. Utilizzare regolazione del fuoco grossolana e fine per portare l'immagine a fuoco.
4. Attivare la morsa a vuoto premendo il pulsante vuoto sul controller. Ruotare e bloccare l'obiettivo 10X in place. Messa a fuoco ancora una volta con regolazioni grossolane e fini.
5. Caricare il CapSure Macro LCM tappi (Life Technologies) nel modulo cassetta CapSure e posizionare un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento Cap e posizione intorno al tappo. Sollevare il braccio del Collocamento Cap per rimuovere il tappo CapSure dal modulo cassetta.
6. Ruotare il braccio di posizionamento Cap sul vetrino e abbassare il braccio verso il basso sul vetrino, questo mettere il tappo sulla diapositiva. Regolare la messa a fuoco micrometrica e muovere il joystick per verificare se le cellule sono all'interno del cerchio nero sul tappo. Tutte le catture cellule dovrebbero essere all'interno di questo cerchio nero.
7. Impostare i parametri laser. In primo luogo, premere il pulsante di abilitazione laser sul controller. Lo spot laser bersaglio sarà visibile come un punto rosa nel campo visivo sul monitor del computer.
8. Impostare la dimensione dello spot laser a piccole (7,5 micron) per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza e la durata a 65 - 75 mW, per 1,0-2,0 msec come necessario per la cattura cellulare ottimale.
9. Per test il laser, utilizzare il joystick per spostare il punto laser in una zona dove non ci sono le cellule a raccogliere. Fuoco il laser con l'interruttore pollice. Utilizzare il joystick per spostare il punto laser di distanza dal punto polimero fuso e controllare per vedere se un anello scuro visibile circonda uno spazio libero in cui è stato sparato il laser.
10. Per catturare celle, utilizzare il joystick per spostare il punto laser sulla superficie di cellule di catturare. Fuoco il laser con l'interruttore pollice. Spostare il joystick mentre si aziona il laser per catturare una grande area di celle. Quando il laser viene sparato scioglie il film di polimero termoplastico sul tappo alla superficie delle cellule bersaglio. Il polimero assorbe la radiazione laser, quindi non alterando l', DNA RNA o proteina garantire l'integrità del campione per future applicazioni molecolari.
11. Dopo la cottura tutte le cellule di interesse, sollevare il braccio di posizionamento Cap. Le cellule raccolte si separerà dal sezione di tessuto e aderire al tappo CapSure. Il tessuto residuo e le cellule mancanti saranno visbile nel campo di vista. Le cellule del tappo può anche essere visualizzato posizionando il tappo su una parte vuota della diapositiva.
12. Sollevare il braccio di posizionamento Cap e ruotarla per Scaricare il Cap stazione. Abbassare il coperchio nella stazione e ruotare il braccio di posizionamento Cap nella sua posizione precedente.
13. Far scorrere lo strumento CapSure inserimento lungo la piattaforma e sul cappuccio. Sollevare lo strumento dalla piattaforma. Il tappo resterà attaccato. Toccare leggermente il tappo al pad CapSure pulito per pulire via i tessuti indesiderati.
14. Mettere il tappo in un ml 0.5 RNasi-free tubo riempito con 100 ml di tampone di lisi ottenuto dalla RNAqueous Micro-Kit di isolamento. Immediatamente vortex il tappo per 30 sec per lisare le cellule. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e congelare a -80 ° C fino isolamento dell'RNA.

LCM di singoli FJ + neuroni nell'ippocampo

15. Per catturare singole cellule, caricare CapSure HS LCM tappi nel modulo cassetto CapSure e positisu un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento Cap e posizionarla intorno al tappo. Sollevare il braccio del Collocamento Cap per rimuovere il tappo CapSure dal modulo cassetta.
16. Impostare la dimensione dello spot laser a piccole (7,5 micron) per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza del laser e la durata di 65 -75 mW per 0,45-0,50 msec per la cattura cellulare ottimale di cellule singole.
17. Ruotare il braccio di posizionamento Cap sul vetrino e abbassare il braccio verso il vetrino. Questo metterà il cappuccio sulla diapositiva. Il CAPSURE HS superficie della calotta si siede elevato dal campione durante il LCM.
18. Utilizzare il joystick per spostare il laser su singoli FJ + cellule. Tutte le cellule di essere catturati devono essere all'interno del piccolo anello nero sul tappo. Fuoco il laser con l'interruttore pollice.
19. Quando tutte le celle all'interno dell'area cerchio nero sono stati sparati con il laser, sollevare il braccio di posizionamento Cap. Le cellule catturate separerà dalla sezione di tessuto e aderire alla HS CapSure tappo.
20. Posizionare un altro vetrino sul Microsfar fronte palco e raccogliere FJ + cellule fino a quando il tappo HS è pieno. Mettere il tappo in un ml 0.5 RNasi-free tubo riempito con 40-50 ml di tampone di lisi. Immediatamente vortex il tappo per 30 sec per lisare le cellule. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e congelare a -80 ° C fino isolamento dell'RNA.

4. Totale isolamento di RNA da campioni di LCM (Questa sezione sarà solo essere descritta nel video di presentazione)

1. RNA totale da cellule viene isolato impiegando la RNAqueous Micro-Kit (Ambion) seguendo i protocolli del produttore. Tutti i reagenti e le soluzioni di lavaggio sono forniti in questo kit. Pre-bagnato del microfiltro cartuccia aggiungendo 30 pl di tampone di lisi soluzione al filtro. Dopo 5 min, centrifugare il filtro per 30 sec a 10.000 × g.
2. Aggiungere 3 ml di additivo LCM al lisato campione, pipetta per mescolare e centrifugare.
3. Aggiungere 52 ml di ETOH 100% (1/2 volume) al lisato campione; pipetta per mescolare, e trasferire il lisato al filtrocolonna.
4. Centrifugare la colonna filtro a 10.000 g per 1 min per legare l'RNA alla colonna. Se ci sono tappi multiple per un campione, ruotare ciascun lisato attraverso la colonna stessa separatamente.
5. Completare la procedura di isolamento di RNA come descritto nel kit RNAqueous Micro.
6. Eseguire DNasi trattamento e inattivazione di DNasi LCM campioni di RNA, come descritto nel kit, trasferire l'RNA a una RNasi-free tubo e conservare a -80 ° C.

5. Quantificazione RNA e applicazioni a valle

Valutazione della qualità dell'RNA e la quantificazione viene eseguita con un Bioanalyzer Agilent utilizzando reagenti del kit di Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) seguendo il protocollo del produttore.

1. RNA totale è analizzato su un Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies). Il software valuta la concentrazione e l'integrità del campione RNA assegnando un numero integrità dell'RNA (RIN) di ciascun campione f vannorom 1 a 10. 1-5 indica RNA degradate e 7-10 indica RNA di buona qualità.
2. RNA intatto non degradati saranno utilizzati per Real-Time PCR, singoli saggi TaqMan o RT2 array profiler con Sybr-chimica verde. L'RNA può essere utilizzato anche per l'analisi microarray mRNA e microRNA microarray.

Nel nostro studio LCM in primo luogo, siamo stati in grado di dimostrare che le sub-regioni funzionalmente distinte (CA1 e CA3) dell'ippocampo di ratto hanno profili di espressione genica che riflettono la loro vulnerabilità al trauma cranico. ⁸ Figura 1A-1C mostra cattura laser di neuroni piramidali dell'ippocampo (CA1- CA3), i neuroni giro dentato e neuroni SCN prima, e dopo il LCM. Cattura Pulire piramidale, granulo o neuroni SCN, rispettivamente, sono mostrati i tappi macro. Figura 2A-2B illustra morire, i neuroni positivi Fluoro-Jade piramidali e sopravvivere, i neuroni negativi Fluoro-Jade piramidali prima e dopo la LCM. La cattura pulita del morire o sopravvivere neuroni è indicata visualizzando le cellule catturate sui cappelli LCM.

Dopo LCM, l'RNA totale può essere utilizzato per una gamma diversificata di studi molecolari compresi quantitativa real-time PCR dell'espressione genica utilizzando TaqMan o SYBR chimiche verdi (Figura 3A), piccolo focused array PCR con sonde SYBR Green (Figura 3B) o interi genoma studi microarray (Figura 3C).

Figura 1. Cattura microdissezione laser di andane di popolazioni di cellule definite dal cervello di ratto. Congelati 10 sezioni micron coronali del cervello di ratto sono fissati in etanolo, tinto con un Nissl macchia (cresile viola) e preparati per LCM. Vengono mostrati foto dell'ippocampo di ratto e nucleo soprachiasmatico prima e dopo LCM e le cellule catturate come visualizzato sul tappo macro. Neuroni piramidali A. dai CA1-CA3 sottocampi dell'ippocampo di ratto. Cellule granulari B. nel giro dentato dell'ippocampo. C. bilaterale nucleo soprachiasmatico posta a cavallo del terzo ventricoloe si trova al di sopra del chiasma ottico. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Cattura microdissezione laser di singoli neuroni di ippocampo di ratto. Vengono mostrati A. Degenerare, Fluoro-Jade-positivi (tinto) ippocampali CA3 neuroni e B. Surviving, Fluoro-Jade-negativi (non colorati) CA3 neuroni prima e dopo LCM. Cellule catturate vengono visualizzate. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. L'analisi dell'espressione genica di RNA totale isolato da neuroni laser catturati. A. quantitativi in tempo reale PCR dati di espressione genica orologio circadiano in SCN. Heatmap B. di espressione genica nel morire e sopravvivere neuroni dell'ippocampo che mostrano espressione di apoptosi geni correlati con focalizzati array PCR . C. Agilent dell'intero genoma analisi microarray di espressione genica in ippocampali CA1-CA3 neuroni di ratti che hanno ricevuto lesioni finzione, trauma cranico o trauma cranico più un ricombinante adeno-associato virus siRNA progettata per atterramento espressione di geni indotti da lesioni cerebrali (ossido nitrico neuronale sintasi e glutatione perossidasi-1). Clicca qui per ingrandire la figura .

Questa tecnica LCM ci ha permesso di fare significativi passi avanti nella comprensione dei meccanismi molecolari di trauma cranico. ^{8,10,11,12,13} Siamo stati i primi a investigatori utilizzano questa tecnica per dimostrare che subregioni distinte dell'ippocampo di ratto hanno profili di espressione genica che correlano con la loro vulnerabilità selettiva per infortunio. I nostri studi hanno dimostrato che possiamo quantificare l'espressione genica, per qPCR, da un minimo di 10 celle laser catturati e che potrebbe svolgere il genoma analisi microarray da un minimo di 600 celle catturati. LCM potrebbe essere un valido strumento in studi analoghi di altre regioni del cervello che sono noti per essere implicati in diversi disturbi neurologici e neuropsichiatrici. Per esempio, gli studi che utilizzano LCM hanno fatto luce sulla patogenesi della malattia di Parkinson nei neuroni dopaminergici della substantia nigra, ¹⁴ e aiutato genoma studi di profilazione del nucleus accumbens, che è coinvolto in circuiti di ricompensa implicati in substance disturbi da abuso di ^15.

Eterogeneità neuronale si riflette a livello del genoma ¹⁶ e possono contribuire alla mancanza di successo di trattamenti sperimentali per TBI in studi clinici. Così, il nostro obiettivo è quello di utilizzare questa tecnica per studiare gli elementi critici che influenzano la sopravvivenza neuronale dopo trauma cranico. Nostro recente studio genoma profiling di morire e adiacente superstite neuroni ippocampali dopo TBI suggerito che un reostato cellulare che riflette il rapporto tra i livelli di espressione dei geni per la sopravvivenza delle cellule morte cellulare regola destino cellulare dopo TBI. Questi studi in corso contribuiranno alla progettazione e sviluppo di strategie farmacologici in grado di influenzare positivamente il reostato sopravvivenza cellulare. Inoltre, attualmente in uso LCM per seguire e controllare gli effetti di potenziali trattamenti farmacologici terapeutici in neuroni ippocampali dopo trauma cranico. Così, i nostri studi dimostrano che i dati accurati RNase-free e alcune tecniche di manipolazionemodifiche di protocolli esistenti, è possibile ottenere elevate qualità campioni di RNA da LCM per accurate analisi quantitativa dell'espressione genica.

Tuttavia ci sono alcuni trabocchetti associati a tecniche di LCM. Per esempio, raccogliendo solo le cellule neuronali senza contaminazioni microglia può essere quasi impossibile. Nello strato di cellule piramidali dell'ippocampo è stato stimato che il 95% delle cellule sono neuroni con il 90% di questa popolazione da cellule piramidali e interneuroni 10%, lasciando una piccola percentuale di tipi di cellule gliali e altri. ^{8,17, 18} Nei nostri studi utilizziamo Fluoro-giada un colorante fluorescente che etichetta specificamente solo i neuroni danneggiati nel tessuto cerebrale. Una macchia differente che è un marcatore per GFAP sarebbe necessario per colorare microglia. ¹⁹ Raccolta solo le Fluoro-Jade macchiati singoli corpi neuronali garantisce una popolazione omogenea di neuroni. Un altro problema comune che può richiedere la risoluzione dei problemi è che un cerchio non èt definito quando il laser viene sparato. Se ciò si verifica, è necessario controllare le impostazioni laser e regolare la potenza e la durata necessarie. Inoltre è importante accertarsi che il cappuccio sia appiattito sul tessuto e posizionati correttamente nel braccio. Facendo riferimento al manuale LCM tecnico o chiamando il supporto tecnico a volte sarà necessario. Seguendo LCM e isolamento dell'RNA, la qualità del RNA deve sempre essere valutato utilizzando un bioanalizzatore prima di qualsiasi analisi di espressione genica.

Ci sono diversi tipi di strumenti di cattura laser attualmente presenti sul mercato, tra cui taglio laser (Life Technologies, Leica Microsystems) e laser catapultando (Zeiss) strumenti. Il nostro sistema di LCM funziona bene per l'acquisizione di un piccolo numero di cellule. Altri sistemi ad alto rendimento e più automatizzato può essere più adatto per ottenere un maggior numero di cellule per analisi genomica e proteomica particolare. Infatti, LCM utilizzando questi sistemi automatici ha un grande potenziale per l'analisi dei protein espressione in cellule identificate o popolazioni arricchite di cellule. ²⁰ Inoltre, LCM può facilitare l'analisi di espressione genica di cellule immunolabeled, ²¹ consentono di investigare l'espressione genica in cellule tipi definiti indipendentemente dalla complessità nei tessuti più eterogenei. Così, LCM è un ottimo strumento per gli studi molecolari all'avanguardia di popolazioni singole o arricchito di cellule.