칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup> 2 +</sup> 과도하고 막 전류
Summary
우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를 설명<sup> 2 +</sup전기 생리학 패치 – 클램프 연구와 함께> 측정.
Abstract
패치 클램프 기법과 심장 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성의 연구는 + 처리 이상 격리 심근이 필요합니다. 또한, 이러한 기술을 사용하여 환자의 근육 세포를 조사 할 수있는 가능성은 심방 세동 (AF)와 같은 심장 질환의 분자 기초를 해명하는 귀중한 요구 사항입니다. 여기에 1 우리는 모두에 적합한 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명 패치 클램프 연구와 세포 내 칼슘 2 + 농도의 동시 측정. 첫째, 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기는 작은 조직 덩어리 ( "청크 방법")로 잘게 + 무료 솔루션 칼슘에 씻어 수 있습니다. 그런 다음 조직 덩어리가 20 μM 칼슘 2 + 솔루션을 포함하는 콜라게나 제와 단백질 분해 효소로 소화된다. 그 후, 고립 된 근육 세포는 하브 있습니다조직 현탁액의 여과 및 원심 분리하여 STED. 마지막으로, 세포 스토리지 솔루션에 칼슘 2 + 농도는 0.2 mm까지 단계적으로 조정됩니다. 우리는 간단히 +와 칼슘 2 + 분리 과정에서 버퍼링도 활동 전위와 막 전류의 대표 녹음을 제공하고, 모두 함께 동시에 칼슘 2 + 과도 측정이 고립 된 근육 세포에서 수행과 칼슘의 의미를 설명합니다.
Introduction
패치 클램프 기술과 + 핸들링 이상 격리 된 심근을 필요로 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성을 공부합니다. 이들은 일반적으로 소화 효소에 심장 조직 샘플의 체외 노출 (콜라, 히알루, 펩티드 등)에 따라 얻을 수 있습니다. 1955 2 가능한 심장 근육 세포의 분리의 첫 번째 보고서 이후 프로토콜의 큰 양 마우스, 쥐, 토끼, 개, 기니 돼지와 인간을 포함한 다른 종에서 하나의 심방과 심실 심근를 수확하기 위해 개발되었습니다. 이 리뷰에서 우리는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 워딩 턴 생화학 공사, 미국 (에서 제공하는 "워딩 턴 조직 해리 가이드"를 참조하십시오 다른 종에서 근육 세포의 분리 절차에 관한 www.tissuedissociation.com을 ).
<p class= "jove_content"> 인간 심방 근육 세포 격리 프로토콜은 일반적으로 여기에 우리가하기 위해 이전에 출판 된 방법에서 적응 기술의 단계별 설명을 제공 Bustamante의, 외. 3에 설명 된 방법에서 파생됩니다 패치 클램프 실험뿐만 아니라, 동시에 세포 내 칼슘 2 + 측정뿐만 아니라 적당한 심방 근육 세포를 얻을 수 있습니다. 4-11Protocol
실험 프로토콜은 로컬 윤리위원회의 승인을 모든 환자가 서면 동의를 제공해야 할 필요가있다. 우리의 연구는 의료 학부 만하임 윤리위원회, 하이델베르크 대학교 (# 2011-216N-MA)에 의해 승인 된 인간의 복지에 대한 모든, 기관 국가 및 국제 지침을 준수 하였다. 모든 환자는 서면 동의를 주었다. 0. 인간의 심방 조직을 얻는 이식 심폐 바이 패스를위한 오픈 심장 수술을받은 환자의 일상 도관의 과정에서, 오른쪽 심방의 끝은 일반적으로 제거되고 심방 심근의 분리에 사용할 수 있습니다. BDM, 수축 억제제, 심근 C 방지, 절제 후 조직 샘플은 2,3 – butanedione monoxime을 (표 I 포함 + 무료 전송 솔루션은 멸균 칼슘 2 50 ML 팔콘 튜브에 즉시 전송됩니다) ontracture. 30 ~ 45 분 사이의 전송 시간으로, 우리는 고립 된 심방 심근의 수와 질 모두에 대해 냉각 또는 산소의 명확한 이점을 인식하지 않았다. 실험실 일반 교통에 가능한 한 빨리해야한다. 긴 수송 시간은 피할 수없는 경우, 4에서 전송 ° C 산소 용액에 유리할 수 있습니다. 1. Prearrangements 재킷 비커 (표 II)의 온도를 제어하는 thermocirculator에 전환합니다. 비커 내부의 온도가 37 ° C.와 동일해야합니다 전체 분리 과정을 통해 비커 내에서 일정한 온도를 유지하기 위해 유리 뚜껑 비커를 다룹니다. 세 개의 유리 비커에 콜라게나 제 I 및 프로테아제 XXIV의 무게를 실온에서 보관하십시오. 효소는 사용 직전에 희석 될 것입니다. 칼슘의 저장소 20 ML 4에서 페트리 접시에 + 무료 솔루션 ° C. 칼슘의 저장 250 ML 37 물 목욕 + 무료 솔루션 ° C. 2. 조직의 청소 페트리 접시 (~ 10 cm 직경)로 전송 솔루션과 함께 조직 샘플을 전송하고 약 가위를 사용하여 지방 조직을 제거합니다. 조직 샘플의 무게. 200과 600 mg의 세포 분리에 사용됩니다. 나머지 조직은 나중에 생화학 적 분석을 위해 액체 질소에 냉동 수 있습니다. 20 ML 칼슘이 들어있는 페트리 접시에 조직 샘플을 전송 4에서 + 무료 솔루션 ° C (단계 1.3 참조)의 크기는 약 1mm 3 작은 덩어리로 조직 샘플을 잘라. 다음 단계는 100 % O 2 37 ° C에서 지속적인 가스 처리에서 실행해야합니다. 피펫 팁은 강력한 버블 링을 방지하고 지속적인 공기 흐름을 생성하기 위해 산소 튜브에 배치 할 수 있습니다. 에서 칼슘 2 + 무료 솔루션과 함께 조직 덩어리를 전송재킷 비커에와 자석 교반 막대 약 3 분 동안주의 깊게 약동하십시오. 교반을 중지하고 조직 덩어리가 몇 초 동안 정착 할 수 있습니다. 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 상층 액을 조심스럽게 변형. 집게를 사용하여 비커에 메쉬 절제된 조직 덩어리를 반환합니다. 칼슘과 보충 비커 + 무료 솔루션 및 세척 단계에게 2.4 2.5 두 번 반복합니다. 3. 첫 번째 효소 소화 콜라게나 제와 단백질 분해 효소를 포함하는 20 ML 효소 솔루션 E1 (표 I)와 조직 덩어리를 다시 중지하고 10 분 동안주의 깊게 약동하십시오. 20 μM 칼슘 2 +의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다. 35 분 조직 덩어리의 대부분은 비커에 남아있는 방식으로 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형 한 후. 나머지를 반환메쉬 비커에 조직 덩어리 비가 내렸다. 4. 두 번째 효소 소화 난 단지 20 ML 효소 솔루션 E2 포함 된 콜라게나 제 (표 I) 다시 조직 덩어리를 resuspend을. 바로 20 μM 칼슘의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다 +. 두 번째 소화 용 가위 동안 더욱 가끔 조직의 혈전을 잘라합니다. 5 분 후 세포의 분리를 확인 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플을 채취. 막대 모양의 줄이있는 심근이 나타날 때까지 2-3 분마다 반복합니다. 교반을 중지하고 조직 덩어리는 약 20 ~ 30 초 동안 정착 할 수 있습니다. 50 ML 팔콘 튜브 (관)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. 비커에 메쉬 구속 조직 덩어리를 반환합니다. 20 ML 스토와 비커의 조직 덩어리를 다시 일시 중지합니다GE 용액 (표 I) 10 더 디스펜서로 20 ML 혈청 피펫을 사용하여 부드러운 기계적 분쇄하여 세포를 떼어 놓다. 거품 세포의 생존과 품질에 해로운 때문에 거품 형성을 방지하려고합니다. 50 ML 팔콘 튜브 (튜브 B)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. 5. 최종 칼슘의 최종 준비 및 조정 + 농도 10 분 95 XG에서 팔콘 튜브와 B (단계 4.5 및 4.7 참조)를 모두 원심 분리기. 흡인에 의해 조심스럽게 두 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록합니다. 상층 액을 버린다. 1.5 ML 스토리지 솔루션 (표 I) 각 (상온)에서 모두 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 두 번 각 팰콘 10 mM의 염화칼슘 용액 7.5 μL를 추가하고 신중하게 약동하십시오. 각 단계 후 10 분 동안 품어. 0.2 mm의 최종 칼슘 2 + 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 용액 15 μl를 추가합니다. 6. 형광 칼슘 2 + – 표시 플루오 오전 3시 (그림 1) 근육 세포의로드 2 ML의 microcentrifuge 튜브 (에펜 도르프 튜브)에 세포 현탁액의 1.5 ML (튜브 및 / 또는 관 B)를 전송합니다. 다음 단계는 형광 칼슘 2 + 표시 플루오 3의 빛의 감도를 고려에서 실행해야합니다. 플루로 닉 F-127 (표 3) 원액 (20 % 무수 DMSO에 W / V)를 얻을 수있는 44 μL에 플루오 3 막 투과 아세 톡시 메틸 에스테르 유도체 (플루오로-3 AM, 표 III)의 50 μg을 용해 1 ㎜ 플루오-3는 최대 1 주 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 원액, 오전. 15 μl를 추가 플루오 3 1.5 세포 현탁액의 ML (단계 6.1 참조)와 교반을 포함하는 microcentrifuge 관에 원액 오전주의. 광학적으로 불투명 한 상자에 10 분 동안 세포 현탁액을 품어. 간단히 약 6,000 rpm에서 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 1.5 ML 목욕 용액 (표 IV)에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 실험을 시작하기 전에 드 에스테르 화 약 30 분 세포 현탁액을 남겨주세요. 7. 동시에 패치 클램프 Epifluorescent 칼슘 2 + 측정 패치 클램프 측정이 리뷰의 주요 주제 아니기 때문에, 우리는이 기술의 깊이 설명에 더 많은을 제공하는 다른 간행물에 관심있는 독자를 참조하십시오. 11-14 완성도를 위해서 우리가 측정 할 수있는 프로토콜의 간단한 요약을 제공합니다 활동 전위 또는 L-형 칼슘 2 + 전류의 동시 칼슘 2 + 과도 녹음과 함께 두. 실험을하는 동안 근육 세포는 목욕 soluti입니다와 37 ° C에서 superfused 있습니다신속한 재관류 시스템 (Octaflow IITM, ALA 과학 악기, NY)를 사용하여 (표 IV)에. 전압 클램프 실험, K + 전류는 목욕 솔루션에 4-아미노 피리딘 (5 mmol / L)와 BaCl 2 (0.1 mmol / L)를 추가로 차단됩니다. 붕 규산염 유리 미세 전극을 사용하고 피펫 용액 (표 V)로 가득 할 때 MΩ 2-5 저항 팁을해야합니다. 플루오 3에 더하여 (6 단계 참조) 근육 세포의로드 오전 플루오 3는 피펫 용액 (표 V)에 포함되어 있습니다. 형광은 488 nm에서 흥분과 방출되는 빛은 (<520 nm의) [칼슘 2 +] 나는 가정으로 변환됩니다 여기서 K D 플루오 3 일정 = 해리 (864 NM), F = 플루오로-3 형광;. F 최대 = 칼슘 각 실험의 끝에 얻어진 + 포화 형광 12 전기 신호 epifluorescent 칼슘 2 + 신호 모두를 동시에 기록됩니다. 활동 전위는 1.2 임계 강도의 1 밀리 전류 펄스를 사용하여 전류 클램프 모드에서 0.5 Hz로 자극된다. L-타입 칼슘 2 + – 전류 100 밀리가 빠른 나 + 전류, 다음을 비활성화 할 -80 MV의 지주 잠재력과 -40 mV에서 100 밀리 초 램프 펄스를 사용하여 전압 클램프 모드에서 측정 0.5 Hz에서 +10 mV에서 테스트 펄스.
Representative Results
그림 2a는 고립 된 인간의 심방 근육 세포에서 세 가지 대표적인 예를 보여줍니다. 우리는 CellFinder 현미경 슬라이드 (에 세포 현탁액 (단계 5.5) 10 μL 피펫 세포 수율 계량 http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html을 ). 16.5 ± 3.1 cells/10 μL (n은 = 29) 대 5.1 ± 2.3 cells/10 μL : 그림 2B의 평균 세포 수율은 분명히 만성 AF (CAF)의 낮은 세포 수율 경향 환자 샘플 (튜브가 있음을 나타냅니다 (N = 10)는 각각 SR 및 카페에서, p <0.05; 관 B : 17.9 ± 3.9 cells/10 μL (N = 29) 대 5.9 ± SR과 카페에서 2.0 cells/10 μL (n은 = 10), 각각, p = 0.107). 활동 전위 측정 및 세포질 칼슘 2 + 과도의 동시 녹음의 대표적인 예는 그림 3에 나와있다. 조사 세포, T의 약 90 %에그는 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 + 릴리스는 명확하고 일반 세포의 수축을 발생합니다. 이전에보고 된 세포의 무결성에 대한 허용 지표 휴식 막 잠재력은 -73.9에 대한 평균 ± 2.7 MV (N = 10분의 23 근세포 / 명)와 -77.7 ± 1.8 MV (N = 8분의 19 근세포 / 환자 )는 각각 SR, 커피 (p> 0.05) 인치 15 그림 4는 전압 문 L-타입 칼슘 2 + 전류와 세포질 칼슘 2 + 과도의 대표 동시 녹음을 보여줍니다. 비 선택적 β-아드레날린 수용체 작용제 isoprenaline (1 μM)의 적용은 그대로 β-아드레날린 성 신호 전달 폭포를 제안, I 칼슘, L 및 세포질 칼슘 2 + 과도 모두의 진폭을 증가시킵니다. 에프igure 1. 근육 세포 플루오 3의 흐름도는 (단계 6.1-6.5 참조) 프로토콜을로드 오전. M / V, 질량 / 부피. 그림 2. 스토리지 솔루션에서 한 한시간, 고립 된 인간의 심방 근육 세포. B는 스토리지 솔루션에서 세포의 10 μL에서 계산 셀 수율의 ± SEM (단계 5.5 참조)를 의미합니다. 여기서 n은 각 그룹 내에서 준비의 수를 나타냅니다. * P <0.05. 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 동 율동에서 심방 근육 세포에서 + – 과도 (CAT) 및 CHR의 그림 3. 대표 기록술폰산 심방 세동 환자. 최고 : 주입 된 자극 (0.5 Hz에서)에 사용되는 현재의 막 (I M). 아래의 : 막 전위 (V M), 및 트리거 된 고양이 (아래)의 동시 녹음. (보이트 등의 허가를 Replotted. 2012) 15 L-타입 칼슘 2 isoprenaline (1 μM) 효과의 그림 4. 대표 녹음 + 전류 트리거 칼슘 부비동 리듬과 만성 심방 세동 환자에서 심방 근육 세포에서 + – 과도 (CAT). 최고 : 전압 클램프 프로토콜 (0.5 Hz에서). 아래 : 현재 총 순 막 동시 녹음 (I M), 주로 L-타입 칼슘 2 + 전류 (가운데) 및 트리거 된 고양이 (아래) 반영합니다. (보이트의 허가를 Replotted,외. 2012) 15 표 I. 솔루션을 제공합니다. 표 2. 특정 장비. 표 3. 플루오-3와 근육 세포의로드 물질하십시오. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="표 4" fo:content 너비 = "2.5 인치"fo : "> 표 IV. 패치 클램프 목욕 솔루션입니다. 패치 클램프 * 표 V. 피펫 솔루션입니다.
Discussion
여기에서 우리는 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기에서 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명합니다. 세포질 칼슘의 측정이 근육 세포를 사용하기 위해서는 + 우리는 스토리지 솔루션에서 EGTA를 생략하여 앞에서 설명한 방법 4-11 적응.
이미 1970 년에 그것은 근육 세포가 + 소화하는 동안 칼슘의 존재 해리 있지만, 그들 모두가 따라서 수축과 비 생존. 16, 17에 있었다는 것을 관찰되었고, 세포의 분리는 칼슘 2 + 무료 솔루션에서 수행됩니다. 그러나 칼슘의 생리적 농도의 재 도입 + 빠른 칼슘 2 + 유입과 세포의 죽음을 초래. 이것은 원래 짐머만과 훌스에 의해 관류 마음에서 관찰되었다 칼슘 2 + 역설 현상으로 설명하고있다. 7.0의 pH 감소 등의 절연 매체의 18 수정 <타우린 20 또는 칼슘 2 + (단계 3.2 및 4.1 참조), 21뿐만 아니라 스토리지 솔루션 22을 포함 EGTA 격리 된 근육 세포의 저장을 소량의> 19 추가 한모금은 칼슘 2 + 역설 17.을 방지하기 위해 제안되었다 그러나, 그것은 또한 칼슘 2 + EGTA를 통해 버퍼링 L-타입 칼슘의 진폭 + 전류에 의한 칼슘 2 + 과도 진폭과 칼슘 2 + 과도 이상성 붕괴의 결과를 감소하는 것으로 알려져있다. 23 그러므로 우리는 EGTA 생략 일반적인 속성과 monophasic 붕괴와 칼슘 2 + 과도를 얻기 위해 전체 분리 과정을 통해. 칼슘의 세포를 보호하기 위해 + 역설 우리는 0.2 밀리미터까지 단계적 방식의 스토리지 솔루션의 최종 칼슘 2 + 농도를 증가했다.
콜라의 선택은 아마도 성공 심근 절연을위한 가장 중요한 단계입니다. 기존 콜agenases은 클로 스트 리듐 속의 세균 histolyticum에서 얻은 원유 준비하고 다른 단백, polysaccharidases 및 리파제의 숫자뿐만 아니라 콜라가 포함되어 있습니다. 그들의 일반적인 구성 collagenases에 따라 다른 유형으로 나뉩니다. 24 워딩 턴 콜라 유형 I 및 II가 성공적으로 우리의 현재 기술 프로토콜에서 인간의 심방 근육 세포의 분리. 4-10,15,25-30에 사용 된 우리는 콜라게나 제의 사용을 권장합니다 우리는 또한 교원질 유형 II를 사용하여 가능한 세포의 수용 양을 얻을 수 있었지만, I를 입력합니다. 그러나 단 한 번의 콜라 유형 내에서 효소의 활동에 관한 중요한 배치 별 변화가있다. 이러한 변화는주의 일괄 선택 및 분리 절차를 최적화하기 위해 다양한 배치의 테스트를 필요로합니다. 워딩 턴 생화학 공사 (에서 온라인으로 사용할 일괄 선택 도구 http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php)는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 적합한 것으로 표시되었습니다 조성 사용할 배치를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 현재 우리는 콜라가 250 U / MG 콜라 활동, 345 U / MG caseinase 활동, 2.16 U / MG clostripain 활동과 0.48 U / MG 트립신 활동 (제비 # 49H11338)와 I를 입력하십시오.
이 논문에 설명 된 절차를 사용하여 얻은 세포 패치 – 클램프 연구, 칼슘 2 + 과도 측정하고 또한 모두. 15 조합을 8 시간에서 사용할 수 있습니다,이 세포는 전기장 자극에 대한 응답으로 세포의 수축을 측정 할 수 있도록 또는 전기 자극 패치 – 클램프 피펫 (게시되지 않은 관찰)를 사용.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
또한, 우리는 그들의 우수한 기술 지원을위한 인간의 심방 조직과 클라우디아 Liebetrau, 카트린 Kupser 및 라모나 나겔의 제공에 하이델베르크 대학에서 심장 외과 감사합니다. 그의 도움이 제안과 칼슘 2 + 과도 측정을 설정하는 동안 조언도 앤디 W. 트래포드에 특별한 감사합니다. 그들은 세포의 전기 생리학 및 심근 분리의 기본 기술과 기술을 배우기 위하여 저희에게 제공하는 기회를 기술의 드레스덴 대학 : 저자는 약리학 및 독물학의 부 (어슐러 까마귀 머리)의 구성원에게 그들의 깊은 감사를 표현하고 싶습니다.
저자의 연구는 독일 연구 재단 (Do769/1-1-3), 심방 세동 역량 네트워크를 통해 독일 연방 교육 연구부 (01Gi0204) 심장 혈관 연구에 대한 독일의 센터를 통해 유럽 연합에 의해 지원됩니다 유럽 연합 (EU)심방 세동의 번역 연구 ropean 네트워크 (EUTRAF, FP7 – 건강 – 2010 년 대규모 적분 프로젝트 제안 번호 261057)과 유럽 북미 심방 세동 연구 연합 (ENAFRA) 매그 Leducq (07CVD03)의 교부.
비디오 파일에 나와있는 회로도 개요는 Servier의 의료 기술을 사용하여 제작되었습니다.
Materials
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| Company | Catalogue number | Bath solution | |
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| Company | Catalogue number | Pipette solution | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
References
- Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
- Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
- Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
- Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
- Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
- Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
- Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
- Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
- Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
- Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
- Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
- Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
- Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a “KB medium”. Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
- Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
- Worthington, K., Worthington, V. . Worthington Enzyme Manual. , (1993).
- Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
- Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
- Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
- Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
- Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
- Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).
Citer Cet Article
Voigt, N., Zhou, X., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents. J. Vis. Exp. (77), e50235, doi:10.3791/50235 (2013).