カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離^{2 +}過渡と膜電流

実験プロトコルは、ローカル倫理委員会によって承認される必要があり、すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与える必要があります。我々の研究は、ハイデルベルク大学（＃2011-216N-MA）、医学部マンハイムの倫理委員会によって承認され、人類の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインに準拠して行った。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。 0。ヒト心房組織の取得心肺バイパス移植のための心臓切開手術を受ける患者におけるルーチンカニュレーション手順の間、右心耳の先端部は、通常、除去され、心房心筋細胞の単離に使用することができる。筋細胞Cを防止、BDM、収縮抑制剤、切除後の組織サンプルは、2,3 -ブタンジオンモノオキシムを（ 表I含む滅菌のCa 2 +を含まない輸送溶液を50ミリリットルファルコンチューブにすぐに転送されますontracture）。 30と45分の間の輸送時間で、我々は孤立した心房心筋細胞の数と質の両方に対する冷却または酸素化の明確な利点を認識しませんでした。研究室への一般的な輸送にはできるだけ迅速にする必要があります。長い輸送時間が避けられない場合は、酸素溶液中で4℃輸送℃で有利かもしれない。 1。 Prearrangements ジャケット付ビーカー（ 表II）の温度を制御thermocirculator、スイッチオン。ビーカー内の温度が37℃に等しいことを確認してください全体の分離プロセス全体ビーカー内の温度を一定に維持するために、ガラス蓋付きビーカーをカバーしています。 3ガラス製ビーカーにコラゲナーゼIおよびプロテアーゼXXIVを秤量し、室温で保管してください。酵素は、使用直前に希釈することができる。 のCa 2 20mlのを保存+ 4でペトリ皿に自由溶液℃ののCa 2ストア250ミリリットル37℃の水浴中で+自由溶液℃に 2。ティッシュの清掃ペトリ皿（〜直径10cm）に輸送ソリューションと一緒に組織サンプルを転送し、大体ハサミを使用して脂肪組織を削除します。 組織試料を秤量する。 200〜600 mgの細胞単離のために使用される。残りの組織が保存生化学分析のために液体窒素中で凍結することができる。 20ミリリットルのCa 2 + 4で無料のソリューション°Cを含むペトリ皿に組織サンプルを転送し（ステップ1.3を参照）、約1mm 3サイズでの小さなチャンクに組織サンプルをチョップ。 次の手順は、100％O 2、37℃で、連続処刑の下に実行されるべきである。ピペットチップは、強力な泡立ちを避けるために、連続した空気流を生成するために、酸素チューブに配置することができる。 中のCa 2 +を含まない溶液と一緒にティッシュの塊を転送ジャケットビーカーへと磁気攪拌棒で約3分間注意深くかき混ぜる。 攪拌を停止し、組織の塊は数秒のために落ち着くことができます。ナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を通して上清を慎重にひずみ。メッシュから鉗子を使用してビーカーに拘束され、組織の塊を返します。 リフィルのCa 2ビーカー+送料液及び洗浄工程を2.4と2.5を2回繰り返す。 3。最初の酵素消化コラゲナーゼやプロテアーゼを含んだ20ミリリットル酵素溶液E1（ 表I）で組織の塊を再停止し、10分間注意深くかき混ぜる。 20μMのCa 2 +の最終濃度を得るために、10のCaCl 2溶液を40μLを加える。 35分後には、組織の塊のほとんどがビーカーに残るような方法でナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。残りを返すメッシュからビーカーに組織塊を雨が降った。 4。第二酵素消化私はわずか20ミリリットル酵素溶液E2含むコラゲナーゼ（ 表I）で再び組織の塊を再懸濁します。 20μMのCa 2 +の最終濃度を得るために、すぐに10のCaCl 2溶液を40μLを加える。 第二消化中さらに時折組織血栓をチョップするはさみを使用しています。 5分後、細胞の解離をチェックするパスツールピペットを使用してサンプルを取る。棒状、横紋心筋が表示されるまで、この2〜3分ごとに繰り返します。 攪拌を停止し、組織の塊が約20〜30秒間、落ち着くことができます。 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブ）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。メッシュからビーカーに拘束され、組織の塊を返します。 20ミリリットルストラでビーカー内の組織チャンクを再懸濁さらにGE溶液（ 表I）10とディスペンサーと20ミリリットル血清ピペットを用いて穏やかな機械的粉砕により細胞を解離する。気泡が細胞の生存と品質に有害であるので、気泡の形成を避けるようにしてください。 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブB）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。 5。決勝のCa 2 +濃度の最終準備と調整 10分間、95×gでファルコンチューブAとB（ステップ4.5および4.7を参照）の両方を遠心します。 吸引により慎重に両方のチューブから上清を取り除きます。ペレットを乱さないようにしてください。上清を捨てる。 1.5 mlのストレージソリューション（ 表I）各（室温）の両方でペレットを再懸濁する。 2回ずつファルコン〜10のCaCl 2溶液の7.5μLを加え、慎重にかき混ぜる。各ステップの後に10分間インキュベートする。 0.2mMの最終のCa 2 +濃度を得るために10のCaCl 2溶液15μlのを追加します。 6。蛍光灯のCa 2 +指示薬フルオ-3 AM（ 図1）と筋細胞のロード 2 mlのマイクロ遠心チューブ（エッペンドルフチュー​​ブ）内に細胞懸濁液1.5mlの（チューブおよび/またはチューブB）に移す。 次の手順は、蛍光のCa 2 +インジケーターフルオ-3の光感度を考慮して実行する必要があります。 プルロニックF-127（ 表III）原 ​​液（20％無水DMSO中w / v）で取得するための44μlのフルオ-3の膜透過性のアセトキシメチルエステル誘導体（フルオ-3 AM、 表III）50μgのを溶かす1mMのフルオ3、最大で1週間、-20℃で保存することができる原液、AM。 15μlのを追加フルオ-3は1.5の細胞懸濁液（ステップ6.1を参照）を振とうを含むマイクロチューブに原液AM慎重に。 光学的に不透明なボックスで10分間細胞懸濁液をインキュベートする。 簡単に言えば、約6,000 rpmで遠心。 上清を捨て、1.5 mlの浴溶液（ 表IV）でペレットを再懸濁する。 実験を開始する前に脱エステル化のために約30分間、細胞懸濁液にしておきます。 7。同時パッチクランプと落射蛍光Ca 2 +の測定パッチクランプ測定は、この見直しの主要な話題ではないので、我々はこの技術の深さの説明に多くを提供する他の出版物への興味を持った読者を参照してください。11-14完全を期すために、我々は測定するためのプロトコルの簡単な要約を提供する活動電位またはL型Ca 2 +電流は、同時のCa 2 +過渡録音と一緒に両方。 実験中筋細胞を風呂solutiと37℃で灌流さ急速灌流システム（Octaflow IITM、ALA科学機器、NY）を用いて、（ 表IV）で。電圧クランプ実験のために、K +電流を浴溶液に4 -アミノピリジン（5ミリモル/ L）及び塩化バリウム（0.1ミリモル/ L）を添加することによってブロックされる。ホウケイ酸ガラス微小電極が使用され、ピペット溶液（ 表V）で満たされたときMΩ2-5の抵抗を傾けるしている必要があります。フルオ-3に加えて（ステップ6を参照）筋細胞のローディングAM、フルオ3はピペット溶液（ 表V）に含まれている。蛍光は488 nmで励起して放出された光は、（<520 nm）での[Ca 2 +] iは仮定に変換されますここで、k Dフルオ-3（864のn =解離定数M）、F =フルオ-3蛍光;各実験の終了時に得られたF = 最大のCa 2 + -飽和蛍光12の両方の電気信号及び落射蛍光のCa 2 +信号が同時に記録される。活動電位は1.2倍しきい値強度の1ミリ秒電流パルスを使用して、現在のクランプモードで0.5 Hzで刺激される。 L型Ca 2 +電流は、100ミリ秒に続いて、高速のNa +電流を不活性化するために-40 mVまで-80 mVの、100ミリ秒ランプパルスの保持電位を用いた電圧クランプモードで測定されている0.5 Hzで+10 mVのにテストパルス。