Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Organelas intracelulares são estruturas altamente dinâmicas com diferentes forma e composição, que estão sujeitos a células específicas sinais intrínsecos e extrínsecos. As membranas são freqüentemente justapostas em locais de contato definidas, que se tornam centros de troca de moléculas de sinalização e componentes de membrana ^1,2,3,4. As inter-organellar microdomínios de membrana que são formados entre o retículo endoplasmático (ER) e das mitocôndrias durante a abertura do IP3-sensitive Ca ^{2 +} canal são conhecidos como as mitocôndrias associado-ER membranas ou mams ^4,5,6. A composição de proteína / lípido e propriedades bioquímicas dos sítios de contacto de membrana têm sido extensivamente estudadas em particular em relação ao seu papel na regulação da Ca ^{2 +} intracelular ^4,5,6. O ER serve como o armazenamento primário do Ca ^{2 +} intracelular, e, nessa qualidade regula uma variedade de processos celulares a jusante de sinalização de Ca ^{2 +,} including pós-traducional de dobragem de proteína e proteína maturation7. As mitocôndrias, por outro lado, manter a homeostase ^de Ca2 ^+, por tamponação citosólica ^{concentração} de Ca2 ⁺ que impede a abertura de vias apoptóticas jusante de Ca ^{2 + 4,8} desequilíbrio. A natureza dinâmica das MAMs torna locais ideais para dissecar mecanismos básicos celulares, incluindo Ca ^{2 +} de sinalização e regulação da mitocondrial Ca ^{2 +} sobrevivência concentração biossíntese de lipídios e transporte, metabolismo energético celular e ^{4,9,10,11,12.} Vários protocolos têm sido descritas para a purificação dessas microdomínios de tecido do fígado e células de cultura ^13,14.

Tomando métodos anteriormente publicados em consideração, nós adaptamos um protocolo para o isolamento de mitocôndrias e MAMs a partir do cérebro de rato adulto. Para este procedimento, nós adicionamos uma etapa de purificação extra, ou seja, uma extração de Triton X100, que enables o isolamento da fracção microdomínio enriquecido glicosfingolípidos (GEM) dos MAMs. Estas preparações GEM partes componentes de proteínas com várias cavéolas e lipídico jangadas, derivadas a partir da membrana plasmática ou outras membranas intracelulares, e são propostos para funcionar como pontos de recolha para a agregação de proteínas receptoras e de interacções proteína-proteína ^4,15.