Les mitochondries associées à membranes ER (SMMA) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM): Isolement à partir de cerveau de souris
Summary
Cette procédure illustre comment isoler du cerveau de souris adulte les membranes des mitochondries associées à l'urgence ou la SMMA et les glycosphingolipides-fractions enrichies en microdomaines de MMA propres et préparations mitochondriales.
Abstract
Organites intracellulaires sont des structures très dynamiques avec plus ou moins de forme et de composition, qui sont soumis à des cellules spécifiques indices intrinsèques et extrinsèques. Leurs membranes sont souvent juxtaposées à des sites de contact définies, qui deviennent des plaques tournantes pour l'échange de molécules de signalisation et des composants membranaires 1,2,3,4. Les microdomaines membranaires inter-organites qui sont formées entre le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries lors de l'ouverture de l'IP3 Ca 2 sensible à canal + sont connus comme les mitochondries associé-ER membranes ou SMMA 4,5,6. La composition en protéines / lipides et les propriétés biochimiques de ces sites de contact membranaire ont été étudiés en particulier par rapport à leur rôle dans la régulation intracellulaire de Ca 2 + 4,5,6. L'ER sert le magasin principal de la concentration intracellulaire de Ca 2 +, et à ce titre régit une multitude de processus cellulaires en aval de Ca 2 + signalisation, y comprisuding pliage post-traductionnelle de protéine et protéine maturation7. Mitochondries, d'autre part, maintenir l'homéostasie du Ca 2 +, par mise en mémoire tampon Ca 2 + concentration en empêchant ainsi l'ouverture de voies de l'apoptose en aval du Ca 2 + 4,8 balourd. La nature dynamique des MMA rend sites idéaux pour disséquer les mécanismes de base cellulaires, y compris le Ca 2 + signalisation et la réglementation des mitochondriale de Ca 2 + de survie biosynthèse des lipides concentration, et le transport, le métabolisme énergétique cellulaire et 4,9,10,11,12. Plusieurs protocoles ont été décrits pour la purification de ces microdomaines de tissus du foie et des cellules cultivées 13,14.
Les méthodes de prise en compte précédemment publiées, nous avons adapté un protocole pour l'isolement des mitochondries et des MMA propres du cerveau de souris adulte. Pour cette procédure, nous avons ajouté une étape de purification supplémentaire, à savoir une extraction Triton X100, qui enables de l'isolement du glycosphingolipide enrichi microdomaine (GEM) fraction des MMA. Ces préparations GEM partager des composants de plusieurs protéines avec des radeaux lipidiques et cavéoles, dérivées de la membrane plasmique ou d'autres membranes intracellulaires, et sont proposés à fonctionner comme des lieux de rencontre pour le regroupement des protéines réceptrices et des interactions protéine-protéine 4,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les sites de contact entre les membranes intracellulaires ou organites entre la membrane plasmique des cellules plates-formes représentent dynamiques de signalisation pour les processus cellulaires de base. La caractérisation précise de leur fonction et la composition dans les deux conditions physiologiques et pathologiques nécessite des protocoles de purification fiables et reproductibles. Les méthodes décrites ici ont été spécifiquement optimisés par notre laboratoire pour l'isolement et la purification …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons la contribution de Renata Sano à concevoir le protocole initial. Ad'A. détient les bijoutiers pour les enfants (JFC) de la chaire de génétique et thérapie génique. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH GM60905, DK52025 et CA021764, et les américains libanais syriens Associated Charities (ALSAC).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ | Fisher Scientific | 13-678-20C |
References
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