Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em> Дрозофилы</em
Summary
Мы представляем технику для маркировки отдельных нейронов в центральной нервной системе (ЦНС)<em> Drosophila</em> Эмбрионов, которая позволяет проводить анализ морфологии нейронов либо проходящем свете или конфокальной микроскопии.
Abstract
В этой статье мы расскажем, как индивидуально маркировать нейронов в ЦНС эмбриональные дрозофилы по juxtacellular введения липофильных флуоресцентных маркеров DiI мембраны. Этот метод позволяет визуализировать морфологию клеток нейронов в мельчайших подробностях. Можно пометить любую ячейку в ЦНС: клеточных тел нейронов-мишеней визуализируются при DIC оптики или выражение флуоресцентные генетических маркеров, таких как GFP. После маркировки, DiI может быть преобразована в постоянный коричневое пятно на фотопреобразования, чтобы позволить визуализации морфологии клеток в проходящем свете и DIC оптики. Кроме того, DiI-меченых клеток можно наблюдать непосредственно с конфокальной микроскопии, позволяющий генетически введен флуоресцентных белков репортер, чтобы быть colocalised. Этот метод может быть использован в любое животное, независимо от генотипа, что делает его возможным для анализа мутантных фенотипов на одной резолюции клетки.
Introduction
Знание морфологии нейронов на уровне отдельных клеток является ключевым условием для понимания нейронных соединений и ЦНС функции. Таким образом, с первых дней неврологии, исследователи стремились развивать одну ячейку маркировка техники (см. 7 для исторических лечения этого вопроса). Классические методы, такие как окрашивание Гольджи обеспечивают превосходное разрешение морфологии нейронов, но не подходит, если один пытается маркировать определенный тип нейронов в направленном образом, как окрашивание происходит случайным образом. Разработка методов окрашивания отдельных клеток или внутриклеточных juxtacellular введения красителей из микроэлектродов обратился к требованиям конкретной маркировки.
Применение однократной инъекции нейрона красителя Drosophila представлены основные проблемы, из-за малого размера и организм и его нейронов. Тем не менее, одно окрашивание нейронов эмбрионального Drosophila </em> Нейроны были достигнуты в середине 1980-х годов в лаборатории Кори Гудман 15. Хотя метод был высшей полезно и предоставило некоторые ключевые идеи в механизмах нейронального развития у дрозофилы в течение последних 20-30 лет (2, например, 10), многие рабочие уклонялись от этого, в основном из-за его технических требований.
Наличие в последние годы генетические методы для маркировки нейронов дрозофилы также способствовало непопулярности одной инъекцией красителя нейрона. GAL4-направленной экспрессии мембранных ориентированных конструкций GFP может обеспечить превосходное разрешение нейронной морфологии 1, 20. Однако, этот метод имеет некоторые ограничения: часто неизбежны выражения GFP в несколько ячеек можно скрыть структуру отдельных нейронов и GAL4 драйвер линии могут быть доступны не ездить выражение в конкретных нейронов интерес. MARCM (Mosaic анализ с Repressible Маркер Cell) метод 8 может обеспечить маркировку практически любого нейрона на уровне отдельной клетки, но не может быть успешно использован в зародыше и в начале личинки из-за медленного оборота GAL80 белка.
Учитывая эти ограничения генетической маркировки, мы считаем, что однократное введение красителя нейронов у эмбрионов Drosophila остается ценной техники и заслуживает более широкого применения. Для продвижения этой цели, мы предоставляем здесь подробное описание метода. Иллюстрация из его питание обеспечивается нашей недавней счет морфологии полный набор интернейроны в брюшной neuromeres конца эмбриона Drosophila 14. Это исследование, которое показало, как морфологической изменчивости отдельных нейронов типов клеток и принципы организации neuromere в ЦНС эмбриона, не были бы возможны с любым другим в настоящее время маркировки методом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одно из главных преимуществ Drosophila в качестве модельной системы является то, что она позволяет анализ развития и функционирования на уровне отдельных клеток. Это особенно полезно в отношении нервной системы, где разнообразие типов клеток является исключительно высоким и функции ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом DFG по Гринвичу
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth | 4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Biologie du développement. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
