병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로
Summary
발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 – 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.
Abstract
병아리 배아 신경 튜브의 일렉트로는 신경 세포에 외래 유전자의 발현에 대한 신속하고 효율적인되는 등 많은 장점이 있습니다. 이 논문에서 우리는, 특별히 신경 전구 세포의 하위 집합에 레이블을 지정하기 위해 E2.75에 새 후뇌로 DNA를 electroporate하는 방법을 독특하게 보여줍니다 방법, 방법 개발의 많은 고급 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 수행하는 방법 제공 최대 E14.5합니다. 기반의 플라스미드와 후뇌 세포 (의 interneurons, DA1의 지느러미 가장 하위 그룹)의 하위에 GFP 발현을 유도하는 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템 – 우리는 특정 증강 요소, 크레 / 훈제 연어 등의 소설 유전 도구를 활용했다. 축삭의 탄도와 DA1 축삭의 목표는 다양한 뇌간 지역에서 초기 및 후기 배아 단계에서 다음입니다. 이 전략은 배아 후뇌에 대한 관심의 세포를 타겟팅하고 tra에 대한 고급 기술에 기여개발의 여러 단계에서 회로 형성의 cing.
Introduction
후뇌 오름차순와 신경 네트워크를 내림차순를 통해 중앙과 주변 신경 시스템 간의 통신에 의한 신경계의 중요한 중계 허브를 나타냅니다. 그것은 호흡, 의식, 청각,와 모터 조정 1-3 등의 기본적인 기능을 조절한다. 초기 배아 발달 동안 척추 후뇌는 일시적으로 서로 다른 신경 세포 유형을 형성하고 여러 뇌간 핵 센터 4 생성되는 반복 rhombomeres로의 전후방 (AP) 축을 따라 세분화된다. 후뇌는 개별 신경 세포의 전구 세포가 지정되고 별개의 DV 위치에 3,5,6을 차별화하는 기초와 날개의 접시에 자사의 지느러미 – 복부 (DV) 축을 따라 구분됩니다. 초기 AP와 DV 특정 신경 세포의 패턴 기능 뇌간 회로에의 설립을 관리하는 방법은 크게 알려지지 않은 것입니다.
이 기본에 대한 지식을 얻기 위해질문 도구는 초기 후뇌에있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하려면보다 고급 단계에서 자신의 축삭 탄도와 연결을 추적하기 위해 필요합니다. 우리는 이전에 특정 증강 요소를 활용하고, 초기 병아리 배아 7-9 지느러미 척추의 interneurons의 축삭 궤적을 추적 크레 / LoxP 기반 조건식 시스템에있다. 현재 원고에서 우리는 후뇌를 대상으로하고 수정 일렉트로 전략과 PiggyBac 사용 후기 배아 후뇌의의 interneurons, 축삭과 시냅스 목표를 라벨에 대한 실험 패러다임 업그레이드 – 중재 DNA 전위합니다. 우리의 새로운 전략은 2 최대 12 일 ~ 후뇌과 축삭 돌기 다양한 배아 단계에서 시냅스 사이트의 추적의 한면에 서로 다른 신경 세포 아형의 태그가 일렉트로 다음 수 있습니다. 이 방법에 따라, 우리는 후뇌의의 interneurons의 지느러미 – 대부분의 서브 그룹 (dA1/Atoh1을 + 표시 </s위로> 세포)와 두 개의 반대측 오름차순 축삭 돌기 패턴을 밝혀, 각각은 별개의 삭조에서 다른 AP의 위치와이 신장에서 파생됩니다. DA1 축삭은 프로젝트와 청각 핵, 중뇌 및 소뇌 (10)의 여러 계층에서 폼 시냅스에 발견되었다.
병아리의 electroporation의 조합은 유전자가 신경 세포와 개발의 많은 고급 단계에서 투영 사이트 분석 추적 뇌의 신경 네트워크의 형성을 연구 및 회로 형성을 제어하는 분자 메커니즘을 해명하는 독특한 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
비켜 electroporation에있는 병아리 신경 시스템 개발 20시 세포의 사양과 축삭 지침을 검토하는 가능한, 신뢰할 수있는 효과적인 도구입니다. 이 프로토콜에서는 특정의 interneurons의 조건 라벨을 사용 증강 요소를 사용하여 E2.75에 병아리 후뇌에있는 일렉트로의 모드를 설명합니다. 이 전략은 배아의 고급 단계에서 축삭 노선 계획과 시냅스 사이트의 추적을 가능하게 병아리 게놈에 외?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
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