גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה
Summary
פרוטוקול זה מתאר השיטה של mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.
Abstract
גודל מצמד גדול והתפתחות חיצונית של עוברים שקופים אופטי להפוך את דג הזברה מערכת מודל חוליות יוצאת דופן עבור mutagenesis insertional in vivo באמצעות כתבי ניאון לתייג ביטוי של גנים שעברו מוטציה. מספר מעבדות שנבנו ונבדקו וקטורים משפר וגן המלכודת בדג זברה, באמצעות חלבוני ניאון, מפעילי תעתיק מבוסס LexA Gal4-וככתבי 1-7. היו לי וקטורים אלו שני חסרונות פוטנציאליים: ההחמרה הכי מוצלח (למשל חוסר היכולת להבחין בין אירועים משפר וגן המלכודת) והמוטגניות נמוכה (למשל אינטגרציות לגנים לעתים נדירות המיוצרים אללים null). גן Breaking transposon (GBTs) פותחו כדי לטפל בחסרונות הללו 8-10. יש לנו שונה אחד מוקטורי GBT הראשונים, GBT-R15, לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב הראשי של מלכודת גן וכטב"מ הוסיף: eGFP ככתב המשני לגילוי ישיר של אירועי מלכודת הגן.pplication של Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני מספק שני יתרונות עיקריים. ראשית, היא מגבירה את הרגישות לגנים לידי ביטוי ברמות ביטוי נמוכים. שנית, היא מאפשרת לחוקרים להשתמש בקווי מלכודת גן כמו נהגי Gal4 לביטוי ישיר של transgenes האחר ברקמות ספציפיות מאוד. זה רלוונטי במיוחד לגנים עם פונקציות שאינן חיוניות או מיותר, שבו האינטגרציה מלכודת גן עשויה שלא לגרום לפנוטיפים גלויים. החסרון של שימוש Gal4-VP16 ככתב מלכודת הגן העיקרי הוא שהגנים מקודדים לחלבונים עם רצפי אות N-מסוף אינם ניתנים להשמנה, כמו חלבוני היתוך Gal4-VP16 וכתוצאה מכך צפויים להיות מסוגלת להיכנס לגרעין ולהפעיל שעתוק. חשוב מכך, השימוש בGal4-VP16 לא מראש לבחור עבור חלבונים גרעיניים: אנו התאוששו מוטציות מלכודת גן בגני מקודדי חלבונים המתפקדים בגרעין, ציטופלסמה ואת קרום הפלזמה.
Introduction
mutagenesis insertional הוכיח להיות גישה רבת עוצמה כדי לנתח תפקוד גן במערכות מודל שונים מיצורים חד תאיים כמו חיידקים ושמרים ליצורים רב תאיים כגון עכברים וצמחים. כל ה-DNA אקסוגני (וירוס, transposon או פלסמיד) עשוי לשמש mutagen ידי לקטוע מרכיבים חיוניים של גנים כגון אקסונים או יזמים. היעד האפקטיבי של גישות פשוטות כזו הוא קטן ביותר בגנום גדול ומורכב, שכן אקסונים מהווים רק 1-3% מהגנום חוליות טיפוסיים. גודל היעד אפקטיבי קטן ניתן להתגבר על ידי שיעורי אינטגרציה גבוהה מאוד וקטורית, כפי שהודגם על ידי ההצלחה האדירה של mutagenesis insertional רטרווירלי ב11,12 דג הזברה. לעומת זאת, אינטרונים מהווים כ 20-30% מהגנום חוליות. בדג זברה, וקטורי mutagenesis insertional מבוסס transposon אשר למעשה להציג null או מוטציות hypomorphic חמורות על השתלבות אינטרונים כבר בשם "transposo גן השבירהNS "(GBTs) 8-10. לאינטגרצית מלכודת גן יעילה, הם משתמשים transposon Tol2 מינימאלי 13,14. Mutagenicity של GBTs מסתמך על acceptor אחוי המופק מדג ורצפי הסיום / polyadenylation תעתיק. האלמנטים אחראים להמוטגניות GBT נמצאים לצד על ידי אתרי loxP ישירים לכריתה על ידי recombinase Cre. לכן, הזרקה של Cre mRNA מובילה להחזרה יעילה של מוטציות הנגרמות GBT, למרות שכמה רצפי transposon יישארו במוקד האינטגרציה 9,10.
וקטורי GBT פורסמו לאחרונה להשתמש mRFP כ9,10 כתב מלכודת הגן, מה שמוביל לשני חסרונות פוטנציאליים. ראשית, זה לא ידוע מה חלק של הגנים דג הזברה באים לידי ביטוי ברמה מספיק גבוהה כדי להיות מזוהה על ידי חלבוני היתוך כתב ניאון ישירים. שנית, קבוצה קטנה בלבד של גנים צפויים להיות להם פונקציות חיוניות. הערכה הוא שיש רק 1,400-2,400 הגנים דרושים developme דג הזברהNT 15,16. רוב מוטציות מלכודת הגן אינן צפויות להציג פנוטיפים גלויים ולכן תהיה בעלת תועלת מוגבלת. כדי להתגבר על שתי המגבלות האלה, יש לנו שונה GBT-R15 9,10 לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני (Balciuniene et al. בהכנה). כמו באוגוסט פחות mRFP בGBT-R15, אתר תחילת התרגום הוסר מGal4-VP16. לגילוי ישיר של אירועי מלכודת גנים, הווקטורים שלנו מכילים כתב eGFP תחת שליטתו של 14x Gal4 כטב"מ 17,18.
כמה תכונות נוספות מתוכננות לוקטור מלכודת גן bipartite שלנו. כטב"מ: קלטת eGFP הוא מוקף אתרים ישירים FRT (דרגות אפורות באיור 1). הזרקה של FLP recombinase mRNA מובילה לכריתה של כטב"מ: קלטת eGFP, עוזבת את המוטציה מלכודת גן סימן וזכרה לקרינה eGFP. זה לאחר מכן ניתן להשתמש בקווים מהונדסים שיסמנו רקמות ספציפיות או אירועים התפתחותיים על ידי הקרינה ה-GFP. כמו באחריםGBTs, כל קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים ישירים loxP (מחומשים פתוחים באיור 1). זה עושה את אירועי מלכודת הגן הפיכים על ידי ביטוי של recombinase Cre, קלות הקמת הוכחת יחסי סיבתיות בין אינטגרציה מלכודת גן ספציפית וציין פנוטיפ (איור 2). לבסוף, את קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים הפוכים I-SCEI meganuclease (משולשים שחורים באיור 1). בדרוזופילה, אינטגרציות transposon נהוגות להמיר למחיקות (ליקויים) על ידי כריתה מדויקת של אלמנט P. אין ראיות לכך שכריתה של transposon Tol2 (או כל transposon אחר הפועל בבעלים חוליות כגון יפהפה נרדמת, PiggyBac או AC / DS) יכולה להוביל למחיקות. לפיכך, אנו כללנו אתרי I-SCEI כשיטה פונדקאית פוטנציאלית לגיוס של מחיקות, למרות שאין כל הוכחה שאני-SCEI יכול לגרום למחיקות בדג זברה. יש לציין כי בעוד שמגה I-SCEInuclease ניתן להשתמש כדי להקל על transgenesis בדג זברה, מחשוף ה-DNA על ידי meganuclease I-SCEI משמש ללמוד מנגנוני תיקון DNA, כוללים מועדת לטעויות שאינן הומולוגיים סוף להצטרף, בשמרים ובתאי יונקים 19-22.
שילוב של וקטור מלכודת הגן שלנו יכול להוביל לביטוי eGFP ידי שני מנגנונים שונים. הראשון הוא אירוע מלכודת גן אמיתי (איור 1 ג): הווקטור משתלב גן (IMG לInsertionally מוטציה גנטי), תמליל היתוך בין 5 'לפרוטוקול IMG אנדוגני וGal4-VP16 הוא עשה ותורגם ל חלבון היתוך המכיל N-הסופית של החלבון מקודד על ידי IMG וGal4-VP16. חלבון היתוך זה נקשר ל14x כטב"מ ומפעיל שעתוק של eGFP. האירוע השני, פחות הרצוי הוא מלכודת משפר (1D איור): האמרגן המינימלי מול eGFP נופל תחת שליטתו של משפר סמוך לאתר האינטגרציה, מה שמוביל לייצור של eGFP בabהיגיון של ייצור Gal4-VP16. להערכתנו, 30-50% מאירועי ביטוי eGFP הן בשל מלכודת משפר ו50-70% הם תוצאה של מלכודת גן 23 (Balciuniene et al. בהכנה). כדי להבחין בין שני סוגים של אירועים אלה, עשינו 14xUAS: קו מהונדס mRFP (איור 1), לנוחיות בסימן γCry עדשה ספציפית: (. Balciuniene ואח' בהכנה) ה-GFP. אירועי מלכודת הגן מאומתים על ידי שיתוף ביטוי של ה-GFP וRFP (השווה C ו-D באיור 2).
במסך הטייס שלנו, התאוששו מעל 40 אירועי מלכודת גן לאחר הקרנת 270 דגי F0 הוזרקו תערובת של דנ"א transposon וmRNA transposase. שתיים מאינטגרציות מלכודת הגן שלנו התרחשו בגנים עם מוטציות כימית המושרה שפורסמו בעבר: NSF וFLR. פנוטיפים של tpl6 מוטציות insertional NSF וtpl24 FLR הם נבדלים באופן שטחי מפנוטיפים של מוטציות כימית המושרה המקבילות. אנחנו גם ציינו כי אירועי מלכודת הגן יופיעו עם נטייה לאינטרונים ליד הקצה '5 של גנים, ובכך להגדיל את ההסתברות של אללים null. אנחנו עדיין צופים מידה מסוימת של השתקת כטב"מ (ססגון) בכל קווי מלכודת הגן שלנו, וכמה לוקוסים הם באופן ברור יותר רגישים ססגון יותר מאחרים. אנחנו לא מאמינים שהשתקת כטב"מ היא בעיה משמעותית עבור התפשטות של קווי מלכודת הגן, כפי שהצלחנו להפיץ את כל קווי מלכודת הגן שלנו בקלות דרך לפחות חמישה דורות על ידי בחירה לביטוי של GFP לבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
וקטורי מלכודת הגן והמתודולוגיה מתוארים כאן כבר נמצאים בשימוש במספר מעבדות עצמאיות. מניסיוננו, יש שני שלבים קריטיים בתהליך. הצעד הקריטי הראשון הוא להשיג שיעור גבוה של אינטגרציה מלכודת גן בעוברי F0 מוזרק. כישלון בשלב זה לעתים קרובות ניתן לייחס לזיהום RNase של ריאגנטים ההזרקה, במיוחד את ה-DNA miniprep. זה גם מאוד חשוב להזריק עוברים בשלב התא 1 לניסויי מלכודת גן. מניסיוננו, transgenesis בתיווך Tol2 הוא יעיל מאוד, מה שהופך אותו ניתן להשיג קווים מהונדסים גם כאשר הזרקה תאוחר משלב התא 1 או עם ה-DNA באיכות נמוכה יותר. זריקות ירודים הן הרבה יותר בעייתי בעת ביצוע mutagenesis מלכודת גן, שכן רק חלק קטן של אינטגרציות וקטור לגרום לאירועי מלכודת גן יעילים. השלב הקריטי השני הוא לברר אירועי מלכודת גן על ידי חצייה לכטב"מ שלנו: קו mRFP. העדר ביטוי mRFP הואכמעט תמיד מעיד על אירוע מלכודת משפר. עם זאת, לעתים חוסר ביטוי mRFP עשוי להצביע על השתקה של 14x כטב"מ. לכן חשוב לשמור על כטב"מ: קו mRFP במדינה שאינה מושתק על ידי הפצת הדור הבא באמצעות אנשים עם ביטוי הגבוה RFP כאשר חצו לtpl6 NSF.
אנחנו יכולים לחזות מה שהופך את מספר שיפורים לוקטורי מלכודת הגן שלנו ופרוטוקול. הראשון הוא להשתמש בכטב"מ פחות חוזר על עצמו במבנה מלכודת הגן. הוכח שכטב"מ 5x מספיק כדי להשיג הפעלה מלאה בניסויי תרבית תאים, וכי רצפי כטב"מ פחות חוזר על עצמו הם פחות רגישים למתילציה והשתקת 6,25. זה יכול להיות גם אפשרי לעצב וקטורי מלכודת גן לmutagenesis המותנה באופן מלא, באנלוגיה לווקטורים בשימוש על ידי קונסורציום מלכודת גן העכבר הבינלאומי ולאחרונה מותאמים לדג זברה 2,26,27. שיפור נוסף יהיה להשתמש t שונהמערכת ransposon, למשל יפהפה נרדמת 28, כדי לייצר כטב"מ: קו כתב mRFP. זה יאפשר הזרקה של מלכודות גן מבוססות Tol2 ישירות לתוך קו הכתב וההקרנה של F0s ידי incrossing. יתר על כן, זה היה מונע את השימוש בשני רקע גנטי שונה, מה שהופך את הפרשנות של אובדן פנוטיפים פונקציה פשוטה יותר. אפילו עם שיפורים אלה, פרוטוקול מלכודת גן הכללי Gal4 הוצג כאן עדיין יהיה ישים באופן מלא.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ג'ניפר Emtage לקריאה ביקורתית של כתב היד, ריאן גיל לקבלת סיוע טכני ולעזור בטיפול דג הזברה וד"ר סטיבן ג Ekker (Mayo Clinic, Rochster, מינסוטה) לחומרים כימיים. העבודה שלנו כבר נתמכה על ידי אוניברסיטת טמפל המכללה למדע והטכנולוגיה והמכון הלאומי לבריאות (R01-HD061749).
Materials
| Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | Comments |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
| XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
| mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
| Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
| Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
| Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
| * We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |
References
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Trinh le, A., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Emelyanov, A., Parinov, S. Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish. Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).
- Ellingsen, S., et al. Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome. Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).
- Sivasubbu, S., et al. Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development. Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).
- Clark, K. J., et al. In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome. Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).
- Petzold, A. M., et al. Nicotine response genetics in the zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).
- Balciunas, D., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Génétique. 174 (2), 639-649 (2006).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).
- Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).
- Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells. Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).
- Petzold, A. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
- Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish. Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).
- Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
