Gene Trapping behulp Gal4 in zebravis
Summary
Dit protocol beschrijft de methode van de genetische val insertiemutagenese behulp Gal4-VP16 als primaire verslaggever en GFP / RFP als secundaire verslaggevers in zebravis. Ongeveer een op de tien high-uitdrukken F0 vis opbrengst gene trap nageslacht co-GFP en RFP. De screeningsprocedure kan gemakkelijk worden opgeschaald te passen aan de grootte van het laboratorium dat de insertie mutagenese scherm.
Abstract
Grote legselgrootte en externe ontwikkeling van optisch transparante embryo's maken zebravis een uitzonderlijke gewervelde modelsysteem voor in vivo insertiemutagenese met fluorescerende reporters om de expressie van gemuteerde genen te taggen. Verschillende laboratoria zijn gebouwd en getest enhancer-en gen-val-vectoren in de zebravis, met fluorescerende eiwitten, Gal4-en lexA-gebaseerde transcriptieactivatoren als verslaggevers 1-7. Deze vectoren hebben twee potentiële nadelen: suboptimale stringentie (bijv. gebrek aan vermogen om tussen enhancer-en gen-trap gebeurtenissen) en lage mutageniciteit (bijv. integraties in genen die zelden bereikt nul allelen). Gene Breaking Transposon (GBTS) werden ontwikkeld om deze tekortkomingen te verhelpen 8-10. We hebben een van de gemodificeerde eerste GBT vectoren, GBT-R15, voor gebruik met Gal4-VP16 als primaire gene trap reporter en toegevoegd UAS: eGFP als secundaire reporter voor directe detectie van gene trap gebeurtenissen. Eene toepassing van Gal4-VP16 als primaire gene trap verslaggever biedt twee belangrijke voordelen. Ten eerste verhoogt de gevoeligheid voor genen die bij lage expressieniveaus. Ten tweede kunnen onderzoekers gene trap lijnen als Gal4 drivers directe expressie van andere transgenen in specifieke weefsels. Dit is vooral relevant voor genen met niet-essentiële of overbodige functies, waar gene trap integratie niet kan leiden tot openlijke fenotypes. Het nadeel van Gal4-VP16 als primaire gene trap reporter genen die coderen voor eiwitten met N-eindstandige signaalsequenties zijn niet vatbaar opsluiten, omdat de resulterende Gal4-VP16-fusie-eiwitten zijn waarschijnlijk niet in staat om de kern invoeren en inschakelen transcriptie. Belangrijk is het gebruik van Gal4-VP16 geen voorselectie voor nucleaire eiwit: wij teruggewonnen gene trap mutaties in genen die coderen voor eiwitten die functioneren in de kern, het cytoplasma en het plasmamembraan.
Introduction
Insertie mutagenese heeft bewezen een krachtige aanpak ontleden genfunctie in verschillende modelsystemen van eencellige organismen zoals bacteriën en gist meercellige organismen zoals muizen en planten. Elke exogeen DNA (virus, transposon of plasmide) kunnen als mutageen dienen door het onderbreken van essentiële onderdelen van genen zoals exons of promotors. De effectieve doelwit van dergelijke eenvoudige benaderingen is uiterst klein in grote complexe genomen, omdat exons bevatten slechts 1-3% van een typische gewervelde genoom. Kleine effectieve beoogde omvang kan worden overwonnen door een zeer hoge vector integratie prijzen, zoals geïllustreerd door het grote succes van retrovirale mutagenese in zebravis 11,12. Daarentegen introns omvatten ongeveer 20-30% van vertebraten. In zebravis-transposon gebaseerde insertiemutagenese vectoren die effectief null-of ernstige hypomorphic mutaties op de integratie te introduceren in introns zijn genoemd "gen breken transposons "(GBTS) 8-10. Voor een efficiënte gene trap integratie, gebruiken ze een minimale Tol2 transposon 13,14. Mutageniteit van GBTS is gebaseerd op vis afgeleide splice acceptor en transcriptieterminatie / polyadenyleringssequenties. De elementen die verantwoordelijk zijn voor GBT mutageniteit worden geflankeerd door directe loxP sites voor excisie door Cre recombinase. Aldus injectie van Cre mRNA leidt tot efficiënte reversie van GBT geïnduceerde mutaties, hoewel sommige transposon sequenties blijven integratie locus 9,10.
De onlangs gepubliceerde GBT vectoren gebruiken mRFP als de gene trap verslaggever 9,10, wat leidt tot twee mogelijke tekortkomingen. Ten eerste is het niet bekend welk deel van zebravis genen tot expressie op een voldoende hoog niveau worden gedetecteerd door directe fluorescente reporter fusie-eiwitten. Ten tweede, slechts een kleine subset van genen zal essentiële functies. Er wordt geschat dat er slechts 1,400-2,400 genen die nodig zijn voor de zebravis development 15,16. De meeste gene trap mutanten zullen naar verwachting geen openlijke fenotypes geven en daarom zal beperkt nut hebben. Om deze twee beperkingen te overwinnen, hebben we GBT-R15 9,10 gemodificeerd voor gebruik met Gal4-VP16 als primaire reporter gene trap (Balčiūnienė et al.. In voorbereiding). Zoals met augustus-minder mRFP in GBT-R15, werd de translatiestartplaats verwijderd uit Gal4-VP16. Voor directe detectie van gene trap gebeurtenissen Onze vectoren bevatten een EGFP reportergen onder controle van 14x Gal4 UAS 17,18.
Een aantal extra functies zijn ontworpen in onze bilaterale gene trap vector. De UAS: eGFP cassette wordt geflankeerd door directe FRT-plaatsen (grijze chevrons in Figuur 1). Injectie van Flp recombinase mRNA aanleiding geeft tot excisie van de UAS: eGFP cassette, waardoor de gene trap mutatie ongemarkeerd door eGFP fluorescentie. Het kan vervolgens worden gebruikt in transgene lijnen welke specifieke weefsels of ontwikkelingsprocessen door GFP fluorescentie markeren. Zoals bij andereGBTS, wordt de gehele gene trap-cassette geflankeerd door directe loxP plaatsen (open vijfhoeken in Figuur 1). Hierdoor gene trap gebeurtenissen reversibel door expressie van Cre recombinase, gemakkelijk vaststelling bewijs van causaliteit tussen een specifiek gene trap integratie en waargenomen fenotype (Figuur 2). Tenslotte wordt de gene trap-cassette geflankeerd door inverted I-SCEI meganuclease (zwarte driehoeken in Figuur 1). In Drosophila, worden transposon integraties vaak omgezet in schrappingen (gebreken) door onnauwkeurige excisie van het P element. Er is geen bewijs dat de uitsnijding van Tol2 transposon (of een ander transposon actief in gewervelde dieren zoals Doornroosje, piggyBac of Ac / Ds) kan leiden tot verwijderingen. Wij begrepen daarom I-SCEI sites als een potentiële surrogaat methode voor de inductie van deleties, ook al is er geen bewijs dat I-SCEI schrappingen kunnen induceren in de zebravis. Opgemerkt moet worden dat terwijl I-SCEI meganuclease kan worden gebruikt voor transgenese in zebravis vergemakkelijken, wordt DNA splitsing door I-SCEI meganuclease gebruikt om DNA herstel mechanismen, waaronder foutgevoelige niet-homologe eind mee, in gist en zoogdiercellen 19-22 bestuderen.
Integratie van onze gene trap vector kan leiden tot eGFP expressie door twee verschillende mechanismen. De eerste is een echte gene trap geval (figuur 1C): de vector integreert in een gen (IMG voor Insertionally gemuteerd gen), een fusie transcript tussen de 5 'van de endogene IMG transcript en het Gal4-VP16 is gemaakt en vertaald naar een fusie-eiwit dat de N-terminus van het eiwit gecodeerd door IMG en Gal4-VP16. Dit fusie-eiwit bindt aan de 14x UAS en activeert transcriptie van eGFP. De tweede, minder wenselijke gebeurtenis een enhancer trap (figuur 1D): de minimale promotor voor eGFP valt onder de controle van een versterker bij integratie plaats, wat leidt tot de productie van eGFP in de absence van Gal4-VP16 productie. In onze schatting 30-50% EGFP expressie gebeurtenissen zijn door een versterker vangen en 50-70% het gevolg van een gene trap 23 (Balčiūnienė et al.. In voorbereiding). MRFP transgene lijn (fig. 1B), gemakshalve gekenmerkt door lens-specifieke γCry: (. Balčiūnienė et al., in voorbereiding) GFP onderscheid tussen deze twee klassen van gebeurtenissen, hebben we een 14xUAS gemaakt. Gene trap gebeurtenissen worden geverifieerd door co-expressie van GFP en RFP (vergelijk C en D in figuur 2).
In onze pilot-scherm, we hersteld op 40 gene trap gebeurtenissen na screening 270 F0 vis geïnjecteerd met een mengsel van transposon DNA en transposase mRNA. Twee van onze gene trap integraties hebben voorgedaan in genen met eerder gepubliceerde chemisch-geïnduceerde mutanten: nsf en FLR. De fenotypes van onze insertie mutanten NSF tpl6 en flr tpl24 zijn oppervlakkig te onderscheiden van het fenotypes van de overeenkomstige chemisch geïnduceerde mutanten. We merkten ook op dat gene trap gebeurtenissen weergegeven voorgespannen naar de introns nabije einde van genen de 5 ', waardoor de kans op nul allelen verhogen. Wij nemen een zekere UAS silencing (schakering) in al onze gene trap-lijnen, en sommige loci duidelijk gevoeliger voor afwisseling dan andere. Wij geloven niet dat UAS silencing is een groot probleem voor de vermeerdering van gene trap lijnen, zoals we in staat om gemakkelijk al onze gene trap lijnen voortplanten door ten minste vijf generaties door het selecteren van alleen voor GFP expressie zijn geweest.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gene trap vectoren en methodologie hier beschreven worden al gebruikt in verschillende onafhankelijke laboratoria. In onze ervaring, zijn er twee kritische stappen in het proces. De eerste kritieke stap is om een hoge mate van gene trap integratie in geïnjecteerd F0 embryo bereiken. Niet in deze stap kan vaak worden toegeschreven aan RNase verontreiniging van de injectie reagentia, met name de miniprep DNA. Het is ook heel belangrijk om embryo's te injecteren op de 1 cel podium voor gene trap experimenten. In onze ervaring, Tol2-gemedieerde transgenese is zeer efficiënt, waardoor het mogelijk is om transgene lijnen te verkrijgen, zelfs als later dan de 1 cel podium of injecteren met een lagere kwaliteit DNA. Substandard injecties zijn veel problematischer bij het uitvoeren van gene trap mutagenese, aangezien slechts een kleine fractie van vector integraties resulteren in effectieve gene trap evenementen. De tweede cruciale stap is het gene trap gebeurtenissen nagaan door het kruisen van onze UAS: mRFP lijn. Afwezigheid van mRFP meningsuiting isbijna altijd een indicatie van een versterker val evenement. Echter, soms het gebrek aan mRFP expressie kan zwijgen van de 14x UAS geven. Het is daarom belangrijk om de UAS te behouden: mRFP lijn in een niet-geluidgedempte staat door het uitdragen van de volgende generatie met behulp van personen met hoge RFP expressie wanneer gekruist NSF tpl6.
Wij kunnen voorzien maken van een aantal verbeteringen aan onze gene trap vectoren en protocol. De eerste is een minder herhalend UAS gebruiken in de gene trap-construct. Het is aangetoond dat een 5x UAS voldoende om volledige activering in celcultuur experimenten bereiken en dat minder repetitieve UAS sequenties zijn minder gevoelig voor methylering en zwijgen 6,25. Het kan ook mogelijk zijn om gene trap-vectoren te ontwerpen voor volledig ondergeschikt mutagenese, analoog aan de vectoren die de internationale muis gene trap-consortium en onlangs aangepast zebravis 2,26,27. Een andere verbetering zou zijn in een verschillende transposon systeem, bijvoorbeeld Sleeping Beauty 28, een UAS genereren: mRFP reporter lijn. Dit zou de injectie van Tol2-gebaseerde gen traps in te schakelen direct in de reporter lijn en screening van F0s door incrossing. Bovendien zou dit het gebruik van twee verschillende genetische achtergronden te elimineren, waardoor de interpretatie van functieverlies fenotypen eenvoudiger. Zelfs met deze verbeteringen, zou de algemene Gal4 gene trap protocol hier gepresenteerde nog steeds volledig van toepassing.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Jennifer Emtage voor kritische lezing van het manuscript, Ryan Gill voor technische bijstand en hulp bij de zebravis zorg en dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) voor reagentia. Ons werk werd ondersteund door de Temple University College of Science and Technology en de National Institutes of Health (R01-HD061749).
Materials
| Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | Comments |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
| XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
| mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
| Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
| Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
| Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
| * We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |
References
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Trinh le, A., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Emelyanov, A., Parinov, S. Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish. Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).
- Ellingsen, S., et al. Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome. Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).
- Sivasubbu, S., et al. Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development. Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).
- Clark, K. J., et al. In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome. Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).
- Petzold, A. M., et al. Nicotine response genetics in the zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).
- Balciunas, D., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Génétique. 174 (2), 639-649 (2006).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).
- Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).
- Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells. Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).
- Petzold, A. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
- Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish. Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).
- Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
