Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra
Summary
Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una robusta<em> In vivo</em> Lectura de actividades similares a convulsiones. Esta técnica se puede utilizar con larvas de pez cebra transgénico que lleva genes relacionados con la epilepsia o las convulsiones provocadas por la administración de fármacos anticonvulsivos.
Abstract
La epilepsia afecta a casi 3 millones de personas en los Estados Unidos y hasta 50 millones de personas en todo el mundo. Se define como la aparición de convulsiones no provocadas espontáneos, la epilepsia puede ser adquirido como resultado de un daño cerebral o una mutación genética. Los esfuerzos para convulsiones modelo en animales han utilizado principalmente adquirido insultos (fármacos anticonvulsivos, estimulación o lesión cerebral) y las manipulaciones genéticas (knockdown antisentido, la recombinación homóloga o transgénesis) en roedores. El pez cebra son un sistema modelo vertebrado 1-3 que podría proporcionar una valiosa alternativa a los roedores investigación basada en la epilepsia. El pez cebra se utilizan extensivamente en el estudio de la genética de vertebrados o de desarrollo, presentan un alto grado de similitud genética para los mamíferos y expresar homólogos de ~ 85% de las mutaciones conocidas humanos epilepsia de un solo gen. Debido a su pequeño tamaño (4-6 mm de largo), larvas de pez cebra puede ser mantenido en volúmenes de fluido tan bajo como 100 l durante el desarrollo temprano y arraYED en múltiples pocillos. Los reactivos se pueden añadir directamente a la solución en la que se desarrollan los embriones, la simplificación de la administración del fármaco y que permite una rápida selección de vivo de compuestos de ensayo 4. Los oligonucleótidos sintéticos (morfolinos), mutagénesis, dedo de zinc nucleasa y enfoques transgénicos se pueden utilizar para generar rápidamente desmontables gen o mutación en el pez cebra 5-7. Estas propiedades costear los estudios de pez cebra sin precedentes ventaja estadística sobre el análisis del poder roedores en el estudio de los trastornos neurológicos como la epilepsia. Debido a que el "estándar de oro" para la investigación epilepsia es monitorear y analizar las descargas eléctricas anormales que se originan en una estructura del cerebro central (por ejemplo, convulsiones), un método para grabar de manera eficiente la actividad cerebral en larvas de pez cebra se describe aquí. Este método es una adaptación de las técnicas convencionales de registro extracelular y permite una estabilidad a largo plazo de vigilancia de la actividad cerebral en larvas de pez cebra intacto. Sgrabaciones amplias se muestran para las convulsiones agudas inducidas por la aplicación de fármacos anticonvulsivos baño y convulsiones espontáneas grabadas en un pez modificado genéticamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de registro extracelular presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de la actividad cerebral. Estas grabaciones son análogos a electroencefalográfica (EEG) de seguimiento comúnmente utilizado para evaluar la presencia de descarga eléctrica anormal (es decir, convulsiones) en modelos de roedores de epilepsia y 11 pacientes 12. Grabaciones extracelular se puede combinar con las manipulaciones farmacológicas, como se muestra aquí. Estos tipos de grabaciones …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea dar las gracias a Pedro Castro y Dinday Mateo para sus primeros esfuerzos por establecer pez cebra en el laboratorio. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención EUREKA (# R01NS079214-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
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