Un modello di mouse ortotopico di anaplastico della tiroide Carcinoma

1. Preparazione delle cellule Note: 1) completo RPMI 1640 basata ricetta supporti cultura (500 ml) comprende 435 ml di RPMI 1640, 50 ml di FBS inattivato al calore, 5 ml aminoacidi non essenziali, 5 ml di piruvato di sodio, 5 ml di antibiotico-antimicotico; 2) posto matrigel a 4 ° C un giorno prima della raccolta delle cellule. Linea cellulare umana THJ ATC-11T 8 sono coltivati ​​in 6 piastre di coltura e una volta raccolte e 80-90% confluenti. Cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 4 minuti a temperatura ambiente. Aspirare media e risospendere le cellule in RPMI 1640 supporti [2 ml / 6 pozzetti]. Prendete un piccolo volume di sospensione cellulare, aggiungerlo a un volume di 0,4% tripano colorante blu e determinare la densità delle cellule utilizzando TC10 Automated Cella contatore. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessaria per ottenere 5 x 10 5 cellule / topo volte il numero topi iniezione. Nota: Per garantire annuncio equiparare sospensione cellulare iniettabile, preparare le cellule come se si inietta il doppio del numero di topi (ad esempio, se l'iniezione di 5 topi, quindi preparare sospensione cellulare come se si stesse iniettando 10 topi). Trasferire volume necessario di sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 4 minuti a temperatura ambiente. Aspirare media e risospendere le cellule in RPMI 1640 supporti completi. Trasferire le cellule in una provetta da 1,6 ml, aggiungere 1 volume di matrigel e mescolare delicatamente con pipetta lentamente dentro e fuori. Nota: ogni topo riceverà 10 ml di sospensione / matrigel cocktail cella. Dal 5 x 10 5 cellule sospese in un ml di volume iniettabile 10 sono stati utilizzati con successo in precedenti studi ATC ortotopici 9-10, abbiamo utilizzato i parametri in questo rapporto. Posizionare sospensione cellulare in ghiaccio fino al momento dell'uso. _title "> 2. Preparazione del mouse Pulire la zona chirurgica, che include l'ambito dissezione e dintorni, strofinando tutte le superfici con il 70% di etanolo. Accendere lampade di riscaldamento / pad in cui gli animali saranno sottoposti a chirurgia. Somministrare 0,1 ml di ketamina / xylazina (cocktail di farmaci, comprendente ketamina 9 mg / ml e xylazina 1mg/ml) per 10 g di peso corporeo per via intraperitoneale con un 1 ml, 27G ½ "tubercolina siringa. Prep del mouse per la chirurgia: 1) la barba regione del collo del topo (dalla linea della mascella per cima dello sterno e fuori a braccia), 2) scrub area chirurgica tre volte con chorhexadine imbevuti quadrati di garza, 3) scrub finale fatto con betadine garza imbevuta, 4 ) applicare delicatamente pomate oftalmiche per evitare idratazione degli occhi. Controllare pedale riflesso per garantire il mouse sia adeguatamente sedato. Mettere animale in decubito dorsale su una barriera monouso campo sterile nell'ambito di applicazione dissezione e fissare l'animale in posizione con nastro di stoffa. Scrubs mani ed fingernails poi mettere su guanti chirurgici sterili. In modo sterile, chirurgia aperta imballare e organizzare strumenti. Posizionare telino sterile su animali, lasciando solo sito chirurgico esposto. 3. Chirurgico accesso al Tiroide e Cell iniezione Usando una sterile, monouso bisturi, fare un 1 a 1,5 centimetri incisione longitudinale lungo la linea mediana della gola. Nota: La deviazione dalla linea mediana complica profondo taglio per accedere alla trachea. Abbastanza precisa incisione mediana permette di prendere in giro e tagliare il tessuto membranoso tenendo ghiandole salivari sinistro e destro insieme e riduce il rischio di intaccare o troncare grandi arterie. Eseguire una seconda incisione in muscoli cinghia circondano la trachea poi tirare il lato destro del muscolo incisa a lato per esporre destra ghiandola tiroidea. Hemostats possono essere usati a questo punto per trattenere lo strato muscolare unaparte per un facile accesso alla ghiandola tiroidea (Figura 1). Nota: In alternativa, se procedura eseguita da due staff chirurgico, lo strato muscolare può essere semplicemente trattenuto con una pinza mentre una siringa iniettabile pronta viene consegnato al chirurgo da parte del personale di assistenza. Iniettare lentamente 10 ml di sospensione cellulare in destra ghiandola tiroidea utilizzando un 31G 5/16 "siringa insulina quindi rimuovere delicatamente ago. 4. Chiusura del sito chirurgico e di recupero del mouse Strato muscolare sutura con 6.0 materiale di sutura utilizzando uno stile di sutura continuo o interrotto. Stitch la pelle nello stesso modo. Applicare uno strato di triplo pomata antibiotica direttamente sul sito di incisione. Consentire all'animale di riprendersi in decubito dorsale sul caldo piastra elettrica. Una volta che animale può raggiungere decubito sternale senza assistenza, può essere riposto con altri topi. <p class = "jove_title"> 5. Monitoraggio post-operatorio e Collezione Tissue Controllare il sito di incisione e la salute generale dell'animale al giorno per una settimana dopo l'intervento, quindi controllare una volta alla settimana. Se i punti di sutura sono ancora intatti dopo 14 giorni, vengono rimossi. Nota: Gli animali che presentano segni di declino della salute (ad esempio, la perdita di peso notevole, capelli arruffati, respiro affannoso) devono essere eutanasia e tessuti raccolti. Una volta che i topi hanno raggiunto un predeterminato post-operatorio time-point, amministrare ketamina / xylazina come descritto sopra per sedare. Perfusione intracardiaca animali e il raccolto della tiroide / trachea e altri tessuti di interesse (non descritto in dettaglio qui).