Staphylococcus aureus Tillväxt med humant hemoglobin som järnkälla
Summary
Här beskriver vi en tillväxt-analys för<em> Staphylococcus aureus</em> Använda hemoglobin som den enda källan av tillgängligt näringsämnen järn. Denna analys fastställer rollen av bakteriella faktorer som i hemoglobin-härledd järn förvärv.
Abstract
S. aureus är en patogen bakterie som kräver järn för att utföra viktiga metaboliska funktioner och orsaka sjukdom. Den vanligast förekommande reservoar av järn i den mänskliga värden är heme, som är kofaktorn av hemoglobin. Att förvärva järn från hemoglobin, S. aureus använder ett avancerat system som kallas järn-reglerade yta determinanten (ISD) systemet 1. Komponenter av investeringstjänstedirektivet systemet först binder värd hemoglobin, sedan extrahera och importera hem, och slutligen frigöra järn från hem i den bakteriella cytoplasman 2,3. Denna väg har dissekerats genom många in vitro-studier 4-9. Vidare har bidrag Isd systemet för infektion upprepade gånger visats i musmodeller 8,10-14. Inrättande av bidrag Isd systemet till hemoglobin-härledda järn förvärv och tillväxt har visat sig vara mer utmanande. Tillväxt-analyser med hjälp av hemoglobin som enda järn källa är komplicerade By instabilitet kommersiellt tillgängliga hemoglobin, kontaminerande fritt järn i tillväxtmediet, och toxicitet associerad med järnkelatorer. Här presenterar vi en metod som övervinner dessa begränsningar. Hög kvalitet hemoglobin framställes från färskt blod och lagras i flytande kväve. Renat hemoglobin kompletteras i järn-bryter medel härma järn-dålig miljö möter patogener inuti vertebratvärden. Genom att svälta S. aureus av fritt järn och komplettera med ett minimalt manipulerad form av hemoglobin som vi framkalla tillväxt på ett sätt som är helt beroende av förmågan att binda hemoglobin, extrahera hem, passera hem genom den bakteriella cellen kuvertet och försämra hem i cytoplasman. Denna analys kommer att vara användbart för forskare som vill klarlägga de hemoglobin-/heme-derived järn förvärv i S. aureus och eventuellt andra bakteriella patogener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Järn är ett viktigt näringsämne som krävs av organismer från alla riken i livet 15. I ryggradsdjur, är järn sekvestreras att undvika toxicitet orsakad av detta element. Denna bindning döljer också järn från invaderande mikrober i en process som kallas näringsmässiga immunitet 16. Som svar har patogener utvecklats strategier som kringgår näringsmässiga immunitet. En sådan mekanism förlitar sig på hemoglobin, vilket är det mest förekommande källan för järn i värden 17.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av US Public bidrag Health Service AI69233 och AI073843 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar. EPS är en Burroughs Wellcome Fellow i patogenesen av infektionssjukdomar. KPH finansierades av de cellulära och molekylära mikrobiologi Training bidragsprogram 5 T32 A107611-10.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin’s reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
References
- Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
- Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
- Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
- Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
- Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
- Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
- Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
- Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
- Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
- Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
- Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
- Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
- Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
- Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
- Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
- Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
- Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
- Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
- Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
- Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
- Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochimie. 46, 10675-10684 (2007).
- Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
- Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
- Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
- Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
- Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
- Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
