Summary

Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l'hémoglobine humaine comme source de fer

Published: February 07, 2013
doi:

Summary

Nous décrivons ici un test de croissance pour<em> Staphylococcus aureus</em> En utilisant l'hémoglobine comme la seule source de fer nutritif disponible. Ce test établit le rôle des facteurs bactériens impliqués dans l'hémoglobine dérivée de l'acquisition du fer.

Abstract

S. aureus est une bactérie pathogène qui nécessite de fer pour mener à bien les fonctions vitales du métabolisme et causer des maladies. Le réservoir le plus abondant de fer à l'intérieur de l'hôte humain est l'hème, qui est le cofacteur de l'hémoglobine. Pour acquérir le fer de l'hémoglobine, S. aureus utilise un système complexe connu sous le déterminant de surface régulée par le fer (Isd) système 1. Composants du premier système d'hémoglobine Isd hôte bind, puis extraire et importer l'hème, et enfin libérer de fer de l'hème dans le cytoplasme bactérien 2,3. Cette voie a été disséqué par de nombreuses études de vitro 4-9. En outre, la contribution du système Isd à l'infection a été maintes fois démontrée dans des modèles de souris 8,10-14. Instituant la contribution du système Isd à l'hémoglobine dérivée de l'acquisition du fer et de la croissance s'est avérée plus difficile. Essais de croissance en utilisant l'hémoglobine en tant que source de fer unique sont compliquées by l'instabilité de l'hémoglobine disponible dans le commerce, contaminant fer libre dans le milieu de croissance, et la toxicité associée à des chélateurs du fer. Nous présentons ici une méthode qui permet de surmonter ces limitations. D'hémoglobine de qualité est préparé à partir du sang frais et conservés dans l'azote liquide. L'hémoglobine purifiée est complétée en fer épuiser milieu simulant le milieu pauvre en fer rencontrées par les agents pathogènes à l'intérieur de l'hôte vertébré. En affamant S. aureus de fer libre et en complétant un formulaire de manipulation minimale de l'hémoglobine nous induire la croissance d'une manière qui dépend entièrement de la capacité de lier l'hémoglobine, d'extraire l'hème, l'hème passer à travers l'enveloppe cellulaire bactérienne et de dégrader l'hème dans le cytoplasme. Ce test sera utile pour les chercheurs qui cherchent à élucider les mécanismes de l'acquisition du fer hemoglobin-/heme-derived dans S. aureus et éventuellement d'autres agents pathogènes bactériens.

Protocol

1. Purification de l'hémoglobine à partir de sang frais Acquérir le sang frais humain additionné d'un anticoagulant. Gardez le sang sur la glace ou à 4 ° C tout au long de la purification. Centrifuger le sang pendant 20 min à 1500 x g. Les globules rouges (GR) est au fond du tube. Soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans une solution glacée de NaCl 0,9% (p / v). Répétez la centrifugation et laver 3 fois. Remettre en suspension …

Representative Results

Nous avons purifié l'hémoglobine humaine à partir hémolysat par HPLC (étape Protocole de 1,7). Figure 1 montre enregistrées absorbance de l'éluat à 280 nm et 410 longueurs d'onde. Fraction 5 a été recueilli et autres fractions ont été rejetées. Les rendements de cinq à quinze milligrammes d'hémoglobine par millilitre d'éluat sont généralement acquises. D'hémoglobine purifiée a été analysée par SDS-PAGE en double et les gels ont été soit colorés pour des …

Discussion

Le fer est un nutriment essentiel requis par les organismes de tous les royaumes de la vie 15. Chez les vertébrés, le fer est séquestré à éviter la toxicité provoquée par cet élément. Cette séquestration dissimule aussi le fer de microbes envahisseurs dans un processus connu sous le nom immunité nutritionnel 16. En réponse, les agents pathogènes ont développé des stratégies permettant de contourner l'immunité nutritionnel. Un tel mécanisme repose sur l'hémoglobine, qui e…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par des subventions publiques aux États-Unis des services de santé et AI073843 AI69233 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses. EPS est un Fellow Burroughs Wellcome dans la pathogenèse des maladies infectieuses. KPH a été financé par le cellulaire et moléculaire Microbiologie Subvention de formation Programme 5 T32 A107611-10.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin’s reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochimie. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

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Citer Cet Article
Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

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