Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa
Summary
O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.
Abstract
Um certo número de drogas como alvo as vias de reparação do ADN e induzem a morte de células através da criação de danos no DNA. Assim, os processos para medir directamente danos no ADN têm sido extensivamente estudados. Os métodos tradicionais são o tempo de consuming, de recursos,, caro, intensivo e requerem células de replicadoras. Em contraste, o ensaio cometa, uma única célula de ensaio de electroforese em gel, é mais rápido, não invasivo, medida, de baixo custo directo e sensível de danos no DNA e de reparação. Todas as formas de danos no DNA, bem como a reparação do ADN pode ser visualizado no nível de célula única usando esta técnica poderosa.
O princípio subjacente ao doseamento é que cometa DNA intacto é altamente ordenada ao passo que o dano ao DNA interrompe essa organização. Os danificadas escoa de ADN na matriz de agarose e quando sujeito a um campo eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao cátodo, que está carregado positivamente. As grandes cadeias de DNA não danificadas não são capazes de migrar longe do núcleo. Danos no DNAcria fragmentos menores de DNA que viajam mais longe do que o DNA intacta. Comet Assay, um software de de análise de imagem, as medidas de e compara o global de intensidade de fluorescente de o DNA em o com um núcleo com DNA de que tenha migrado para fora de o núcleo. Sinal fluorescente do DNA migrado é proporcional aos danos de DNA. Tail DNA mais brilhante significa danos no DNA aumentada. Alguns dos parâmetros que são medidos são momento da cauda, que é uma medida de tanto a quantidade de ADN e de distribuição de ADN no comprimento da cauda a cauda, e percentagem de DNA na cauda. Este ensaio permite medir a reparação do ADN, bem desde resolução de danos no DNA significa reparação teve lugar. O limite de sensibilidade é de aproximadamente 50 quebras na cadeia por diplóide 1,2 células de mamíferos. As células tratadas com quaisquer agentes que danificam o ADN, tais como o etoposido, pode ser utilizado como um controlo positivo. Assim, o teste do cometa é um procedimento rápido e eficaz para avaliar os danos do DNA.
Protocol
Discussion
O teste do cometa tem a capacidade única de analisar células individuais. Isto é vantajoso na identificação de subpopulações de células que demonstram respostas diferenciais aos agentes citotóxicos. Algumas limitações práticas têm de ser tidas em conta. O número de células que podem ser avaliadas individualmente podem variar, dependendo do indivíduo. O tamanho da amostra tem de ser aumentada, se há uma variedade de lesões do ADN dentro de uma população. Suspensão de uma única célula viável é cr?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio IMPACTO do Departamento de Radiação Oncológica da Universidade de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, da Fundação da Criança de combate o câncer, ea Gabrielle Anjo (Fundação para ESY.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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