Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli
Summary
Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.
Abstract
Plazma membranı (PM) ve hücre içi bölmeleri arasındaki reseptör ticareti düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle deneysel bir yaklaşım gerektirir. Dahası, böyle bir yaklaşım, aynı zamanda hücre içi bölmelerde olanlardan ÖS lokalize reseptörler ayırt etmek yeteneğine sahip olmalıdır. Her bir vesikül reseptörlerinin sadece küçük bir bölümü taşıyan beri En önemlisi, tek bir vesikül reseptörleri tespit olağanüstü saptama hassasiyet gerektirir. Ve hücrelerin kimyasal sabitleme gerektirir immunolabeled yüzey reseptörleri, floresan mikroskop incelemesi ve bu nedenle yeterli zamansal çözünürlük 1-6 yoksun; reseptör ticareti incelemek için standart yaklaşımlar gerekli mekansal ve zamansal çözünürlükleri de yoksun biyokimyasal algılama, ardından yüzey biyotinilasyon içerir. Bu sınırlamaları aşmak için, biz ve diğerleri geliştirdi ve yeni bir stra istihdam var7-17 mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle PM içine reseptörlerinin dinamik ekleme görselleştirme sağlayan tegy olduğunu. Yaklaşım reseptörlerinin N-terminal hücre dışı etki alanına bir pH-duyarlı GFP, superecliptic pHluorin 18, bir etiketleme içerir. Superecliptic pHluorin asidik pH nötr pH ve floresan olmayan (pH <6.0) Flüoresan olmanın kendine has bir özelliği vardır. Bu nedenle, etiketli reseptör olmayan floresan zaman hücre içi veziküller ticareti ya da endozomal bölmelere bir asidik lümen içinde ve bunlar PM dış yüzeyi üzerinde, hücre dışı nötr pH ortamına maruz yalnızca kolaylıkla görselleştirilebilir hale gelir. Bizim stratejimiz dolayısıyla bize intraselüler kaçakçılığı veziküller içinde olanlardan PM yüzey reseptörleri ayırt etmenizi sağlar. Yeterli uzamsal ve zamansal çözünürlükleri, hem de reseptör dinamik çalışma ticareti için gerekli olan duyarlılık elde etmek için, kullanılan yansıtmak iç toplamBizi optik görüntüleme (~ 170 nm) iyi uzaysal çözünürlüğü elde etmek için etkin iyon floresan mikroskobu (TIRFM), video-oranı mikroskobu (30 kare / sn) ve duyarlılık zamansal çözünürlük tek GFP floresan tespit etmek molekülü. Görüntüleme By TIRFM altında reseptörleri, biz doğrudan bireysel reseptör ekleme olayların kültürü nöronlarında PM içine görselleştirmek başardık pHluorin etiketli. Bu görüntüleme yaklaşımı potansiyel superecliptic pHluorin ile etiketlenmiş edilebilir bir hücre dışı alanı ile herhangi bir zar proteini için uygulanabilir, ve farklı zar proteinleri (reseptörler, iyon kanalları, vs) yerleştirilmesi için yöneten kilit mekanizmasının detaylı bir teşrih izin verecektir PM.
Protocol
Discussion
Bilinmeyen nedenlerden ötürü, fare nöronları zaman sıçan nöronlar daha kültürünün daha zordur. Bizim tecrübelerimize göre, nöronlar ve glia karışık kültürü birincil kültürlü fare nöronları için iyi çalışır. Nöronal somata ve TIRF mikroskopi ulaşamayacağımız dendritik süreçleri diyorum, glia hücreleri üstüne büyürler kültürü nöronlar ve bunların süreçleri bu tür Ancak, böyle bir karma kültür, TIRF görüntüleme deneyler için uygun değildir. Bu nedenle, lamel az gli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Jackson Laboratory başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | SIGMA | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher-Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
