Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano il traffico tra il recettore di membrana plasmatica (PM) e compartimenti intracellulari richiede un approccio sperimentale con ottime risoluzioni spaziali e temporali. Inoltre, tale approccio deve inoltre essere in grado di distinguere recettori localizzati sulla PM da quelli in compartimenti intracellulari. Soprattutto, rilevando recettori in una vescicola singola richiede spiccata sensibilità di rilevamento, poiché ogni vescicola trasporta soltanto un piccolo numero di recettori. Approcci standard per l'esame di traffico recettore includono biotinilazione superficie seguita da rilevamento biochimiche, che manca sia le necessarie risoluzioni spaziali e temporali, e l'esame al microscopio a fluorescenza di recettori di superficie immunolabeled, che richiede la fissazione chimica delle cellule e quindi manca di sufficiente risoluzione temporale ^1-6. Per superare questi limiti, noi e altri hanno sviluppato e utilizzato una nuova strategia che consente la visualizzazione di inserimento dinamico di recettori in PM con eccellenti risoluzioni spaziali e temporali ^7-17. Il metodo comprende la codifica di un pH-sensibile GFP, la superecliptic pHluorin ^18, al N-terminale del dominio extracellulare del recettore. Superecliptic pHluorin ha la proprietà unica di essere fluorescente a pH neutro e non fluorescente a pH acido (pH <6.0). Pertanto, i recettori sono contrassegnati non fluorescente quando all'interno del lume di vescicole acide traffico intracellulare o compartimenti endosomali, e diventano facilmente visualizzato solo quando esposta all'ambiente extracellulare pH neutro, sulla superficie esterna del PM. La nostra strategia permette quindi di distinguere recettori di superficie PM da quelle che, nell'ambito del traffico vescicole intracellulari. Per raggiungere sufficienti risoluzioni spaziali e temporali, nonché la sensibilità necessaria per studiare il traffico dinamica dei recettori, abbiamo impiegato interna totale rifletteremicroscopia a fluorescenza di ioni (TIRFM), che ci ha permesso di ottenere la risoluzione ottimale spaziale di imaging ottico (~ 170 nm), la risoluzione temporale di video-tasso di microscopia (30 fotogrammi / sec), e la sensibilità per rilevare la fluorescenza di GFP unico molecola. Con immagini pHluorin-tagged recettori sotto TIRFM, siamo stati in grado di visualizzare direttamente i singoli eventi recettore inserimento nel PM in neuroni in coltura. Questo approccio di imaging può potenzialmente essere applicato a qualsiasi proteina di membrana con un dominio extracellulare che potrebbe essere etichettato con pHluorin superecliptic, e consentirà dissezione dei meccanismi principali modalità per l'inserimento di differenti proteine ​​di membrana (recettori, canali ionici, trasportatori, ecc) per il PM.