मूल निवासी, रेशेदार लंबी रिक्ति और कमानी लंबी रिक्ति कोलेजन की इन विट्रो संश्लेषण में
Summary
सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रियाओं एक आम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रकार मैं कोलेजन monomer से तीन structurally अलग कोलेजन विधानसभाओं बनाने के लिए वर्णित हैं. मूल प्रकार, रेशेदार लंबे रिक्ति या कमानी लंबे रिक्ति कोलेजन 300 एनएम लंबा और 1.4 एनएम व्यास monomer इमारत ब्लॉक अवगत कराया है जो स्थिति बदलती द्वारा निर्माण किया जा सकता है.
Abstract
कोलेजन तंतुओं संरचनात्मक मचान और यांत्रिक शक्ति प्रदान करने के लिए पशुओं के ऊतकों के बाह्य मैट्रिक्स में मौजूद हैं. इन देशी कोलेजन तंतुओं ~ 67 एनएम के एक विशेषता बैंडिंग आवधिकता है और प्रकार मैं कोलेजन monomers, जो लंबाई और व्यास में 1.4 एनएम में 300 एनएम पदानुक्रमित विधानसभा के माध्यम से इन विट्रो में vivo में गठन किया गया है, जो स्थिति बदलती. monomer इमारत ब्लॉकों उजागर कर रहे हैं, अद्वितीय संरचनाओं तराजू लंबाई में 50 microns को लेकर न केवल देशी प्रकार तंतुओं सहित, निर्माण कर सकते हैं, लेकिन भी रेशेदार लंबे रिक्ति और कमानी लंबे रिक्ति कोलेजन. के साथ साथ, हम एक आम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेजन monomer से तीन अलग कोलेजन संरचनाओं के गठन के लिए प्रक्रिया को प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोकॉल है कि हम और दूसरों को अतीत में प्रकाशित किया है इन तीन प्रकार का प्रयोग आम तौर पर संरचनाओं का मिश्रण करने के लिए नेतृत्व. विशेष रूप से, unbanded तंतुओं च सामान्यतः थेजब देशी कोलेजन बनाने ound, और देशी तंतुओं अक्सर इस अवसर पर उपस्थित थे जब रेशेदार लंबी रिक्ति कोलेजन बनाने. इन नए प्रक्रियाओं वांछित कोलेजन तंतुक प्रकार के उत्पादन के लगभग विशेष रूप से लाभ है. वांछित संरचनाओं के गठन के एक परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी का उपयोग इमेजिंग द्वारा सत्यापित है.
Introduction
कोलेजन संरचनात्मक प्रोटीन है कि एक ट्रिपल पेचदार तीन पॉलीपेप्टाइड जंजीरों से गठित संरचना के एक वर्ग है. ये ट्रिपल पेचदार monomers आगे एक hierarchal तरीके उत्तरोत्तर बड़ा संरचनाओं फार्म में इकट्ठा. वहाँ कम से कम 28 आनुवंशिक रूप से अलग कोलेजन प्रकार है कि 1 की पहचान की गई है. संयुक्त, कोलेजन मैं अप करने के लिए प्रमुख रूप लेखांकन सभी कोलेजन प्रोटीन 2 के 90% प्रकार के साथ कुल जानवरों में पाया प्रोटीन का 30%. टाइप I कोलेजन fibrillous संरचनाओं के रूप में त्वचा, स्नायुबंधन, tendons और हड्डियों में पाया जाता है. परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (AFM) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (EM) प्रकार की छवियों देशी कोलेजन फाइबर मैं आम तौर पर ~ 67 एनएम 3-5 (अक्सर D-बैंडिंग के रूप में संदर्भित) की एक विशेषता अवधि के साथ बैंडिंग दिखा.
प्रकार मैं कोलेजन monomer एक ट्रिपल पेचदार दो समान (मैं) चेन और एक (मैं) α2 α1 चेन, हर एक की तुलना में अधिक से मिलकर heterotrimerहजार एमिनो एसिड होता है. यह लंबी और लंबाई और व्यास में 1.4 एनएम में 300 एनएम के आयामों के साथ पतली है. प्रकार मैं कोलेजन monomer आसानी से स्वाभाविक रूप से गठित उच्च आदेश संरचनाओं टूट 6 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. 7 हम और कई दूसरों 8-10 से पता चला है कि इन घुलनशील monomer इमारत ब्लॉकों तो इन विट्रो में डी बंधी तंतुओं (1 चित्रा) का पुनर्निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
देशी कोलेजन तंतुओं के अलावा, दो अन्य उच्च आदेश कोलेजन संरचनाओं के लिए इन विट्रो में फार्म ही monomer इमारत ब्लॉक का उपयोग कर पाया गया है. दो संरचनाओं रेशेदार लंबे समय (FLS) रिक्ति और कमानी लंबे समय (SLS) रिक्ति कोलेजन (1 चित्रा) हैं. FLS कोलेजन के देशी कोलेजन तरह एक fibrillous निर्माण है, लेकिन एक बड़ा देशी 11 इन विट्रो में कोलेजन से बैंडिंग आवधिकता द्वारा विशेषता है, FLS कोलेजन रूपों जब कोलेजन monomer α1 एसिड glycoprotein साथ संयुक्त है <sup> 12. FLS कोलेजन के रूप में अच्छी तरह से किया गया है vivo में मनाया, हालांकि 13 शायद ही कभी. SLS कोलेजन crystallites रूप में वर्णित है क्योंकि monomers रजिस्टर में की तरह एक क्रिस्टल 14 जाली में जुड़ रहे हैं. SLS कोलेजन रूपों जब कोलेजन monomer adenosine triphosphate (एटीपी) 15 के साथ संयुक्त है. स्वाभाविक रूप से घटनेवाला SLS कोलेजन fibroblasts की संस्कृति के माध्यम में देखा गया है, लेकिन संभावना निकाले ऊतकों के नमूनों में अपने छोटे आकार और वर्गो में विभाजनीय स्थलाकृतिक 16 सुविधाओं की कमी के कारण नहीं है.
इस पांडुलिपि के लक्ष्य के लिए अच्छी तरह FLS और SLS कोलेजन कि भी सबसे अनुभवहीन शोधकर्ता पुन: पेश कर सकते हैं के रूप में देशी कोलेजन तंतुओं को बनाने के लिए विस्तृत प्रक्रिया मौजूद है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उन्नत शुरू सामग्री का उपयोग करना, हम यथासंभव सरल प्रोटोकॉल बनाने की कोशिश की है और अभी भी उन्हें मज़बूती से काम किया है. हम भी विस्तार कैसे एक AFM का उपयोग करने के लिए अलग कोलेजन संरचना विशेषताएँहै कि बना रहे हैं. इस काम शोधकर्ताओं जो एक या एक से अधिक इन उच्च आदेश कोलेजन संरचनाओं के अध्ययन और / या उन्हें अन्य अनुप्रयोगों में व्यापारियों के रूप में उपयोग करना चाहते करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, लेकिन वर्तमान में विशेषज्ञता की कमी या बस ऊतकों के नमूनों के साथ काम करने की इच्छा नहीं है.
Protocol
Representative Results
Discussion
शुद्ध कोलेजन monomer कम पीएच और तापमान पर स्थिर है और देशी कोलेजन तंतुओं के गठन को अनिवार्य रूप से कोलेजन monomer समाधान के पीएच और तापमान स्थापना शामिल है. Monomers से बंधी कोलेजन तंतुओं के पुनर्गठन के लिए प्रक्रिया 50 से अधिक वर्षों के लिए ही अस्तित्व में है. प्रक्रिया है कि हमारे कोलेजन के साथ हमारे पहले के अध्ययन में 15 साल पहले इस्तेमाल प्रयोगशाला 7 प्रक्रियाओं के आधार पर किया गया था 1986 में 10 व्यापारी और सह कार्यकर्ता द्वारा संक्षेप. कोलेजन कि पहले काम में महीन रेशा गठन के लिए शर्तों थे ना 2 4 HPO / 2 KH पीओ 4 (मैं = 0.2, पीएच 7.4) बफर में 0.18 मिलीग्राम / मिलीलीटर कोलेजन monomer की 34 में डिग्री सेल्सियस इस और अन्य प्रक्रियाओं की कोशिश की है कि हम का दोष यह है कि वहाँ हमेशा unbanded वांछित बंधी तंतुओं के साथ – साथ गठित तंतुओं हैं. हमारी नई स्थितियों ~ 0.3 / 7 पीएच पर कोलेजन monomer की मिलीग्राम मिलीग्राम फॉस्फेट 100 मिमी और 100 मिमी KCl में 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया है. संसdure यहाँ बताया प्रक्रिया से पहले हर पहलू में देशी कोलेजन तंतुओं को बनाने के लिए अलग है. लेकिन सबसे ज़ाहिर, हम बफर एकाग्रता बढ़ाने और 100 मिमी KCl जोड़ने ईओण ताकत दोगुनी हो गई है. विशेष रूप से बंधी कोलेजन तंतुओं के गठन में और अधिक सुसंगत ईओण ताकत परिणामों में वृद्धि हुई है.
हमारे अनुभव में, केवल समय है कि इस प्रक्रिया देशी प्रकार कोलेजन का उत्पादन नहीं किया था जब कोलेजन monomer समाधान निर्माता की उपयोग की सिफारिश की तारीख पिछले था. जब ऐसा होता है, जो कम तंतुओं कि सभी कई अभी भी मनाया तंतुओं unbanded लेकिन unbanded predominately पर्वतमाला से मनाया जाता है. ध्यान दें कि अवधि समाप्त हो कोलेजन monomer अक्सर अभी भी सफलतापूर्वक किया जा सकता है देशी कोलेजन बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन जब यह विफल रहता है, नए कोलेजन monomer निश्चित रूप से खरीदा जाना चाहिए.
FLS पहले Highberger एट अल द्वारा की पहचान की थी 17 कोलेजन तैयारी में है. Orekhovic के लिए श्रेय दियाज एट अल. 18. आगे के अध्ययन के Highberger और Schmitt समाप्त करने के लिए कि यह α1-अम्ल ग्लाइकोप्रोटीन कि 12 FLS के गठन को बढ़ावा था नेतृत्व किया. हम बाद में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेजन monomer और कम पीएच एसिड glycoprotein α1 के संयोजन और धीरे धीरे पानी के खिलाफ 24 घंटा 11 के लिए मिश्रण dialyzing पीएच वृद्धि करने के लिए अनुमति देता है FLS कोलेजन बनाने के लिए प्रक्रिया को दोहराने में सक्षम थे. अब हम पानी के खिलाफ कोलेजन monomer 1 dialyzing और बस यह पानी में एसिड glycoprotein α1 साथ संयोजन FLS कोलेजन फार्म है कि प्रक्रिया के एक संशोधन को प्रस्तुत करते हैं. FLS कोलेजन विधानसभा के लिए यहां की परिस्थितियों के बारे में वर्णित बहुत कम समय लगता है. कोलेजन monomer अभी भी पानी के खिलाफ पूर्व dialyzed की जरूरत है, लेकिन यह थोक में किया जा सकता है और फिर 4 में संग्रहीत ° C stably जब तक यह प्रयोग किया जाता है. इस नई प्रक्रिया पैदावार predominately बंधी कोलेजन तंतुओं FLS.
हमारे अनुभव से, α1 एसिड glycoएक कम संयुक्त प्रोटीन और पानी की सामग्री के साथ प्रोटीन, और निष्कर्ष उच्च चीनी सामग्री, सफलतापूर्वक FLS तंतुओं को बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. हम आम तौर पर निर्माता के साथ जाँच करें कि α1 एसिड glycoprotein बहुत उपयोग हम 82 या उससे कम की एक संयुक्त% प्रोटीन और पानी की सामग्री है. और देशी कोलेजन संश्लेषण, कोलेजन monomer कि बहुत पुराना है के लिए प्रक्रिया के साथ के रूप में भी FLS कोलेजन उत्पादन विफलता में परिणाम कर सकते हैं. इसके अलावा, डायलिसिस के लिए उपयोग किए गए पानी की शुद्धता इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, के खिलाफ भी कोलेजन monomer ~ 8 के बजाय MΩ.cm> एक कोलेजन समाधान है कि FLS कोलेजन नहीं बनेगी में 18 MΩ.cm पानी परिणाम की डायलिसिस.
तीन कोलेजन तंतुक प्रकार के, बनाने के लिए आसान SLS कोलेजन है. SLS की जल्द से जल्द तैयारी श्मिट और सह कार्यकर्ता 15 में वर्णित किया गया है. हम SLS कोलेजन बनाने और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध coll का उपयोग करने के लिए उस प्रक्रिया की एक adaption 12 साल पहले प्रकाशित14 एजेंसियों. प्रक्रिया बस entailed 2 मिलीग्राम / एमएल एटीपी और 0.5 / मिलीग्राम 0.05% में कोलेजन monomer की मिलीलीटर (v / v) 3.5 पीएच में एसिटिक एसिड के संयोजन, मिश्रण और कमरे के तापमान पर छोड़ रात भर.
हमारे अनुभव में, SLS विधानसभा के महत्वपूर्ण पहलू यह है कि नियंत्रित किया जाना चाहिए प्रतिक्रिया समाधान के पीएच है. SLS अधिक बुनियादी (~ 3.6-3.9 पीएच) crystallites एकत्रित clumps में शर्तों परिणामों में इकट्ठे हुए. अधिक अम्लीय शर्तों (~ 2.9-3.2 पीएच) पतली 3.3-3.5 पीएच के आदर्श परिस्थितियों में इकट्ठे हुए लोगों की तुलना में अधिक अलग crystallites में परिणाम है. इस रेंज (<2.8 और 4) के बाहर रिएक्शन PHS किसी SLS कोलेजन उपज नहीं है. अतीत में, हम एसिटिक एसिड के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण का पीएच समायोजित. प्रक्रिया आगे भी आसान बनाने के लिए, इस पांडुलिपि में हम एक बफर ग्लाइसिन एचसीएल पीएच नियंत्रण.
तीन अलग कोलेजन प्रोटोकॉल से ऊपर वर्णित गठित संरचनाओं चरित्र हैistic विशेषताएं है कि केवल nanometer संकल्प में सक्षम उपकरणों से discerned किया जा सकता है. मूल निवासी और FLS कोलेजन ~ 67 एनएम और ~ 270 एनएम के आवधिक बैंडिंग द्वारा विशेषता है. SLS कोलेजन के सबसे लंबे समय तक आयाम सिर्फ ~ 360 एनएम. हम विशेष रूप से वर्णन किया है कि कैसे हम एक AFM का उपयोग करने के लिए तीन अलग कोलेजन संरचनाओं विशेषताएँ. हालांकि, संपर्क में या किसी भी जांच AFM <10 एनएम त्रिज्या होने के साथ आंतरायिक संपर्क मोड AFM किसी ऑपरेटिंग भी इन कोलेजन संरचनाओं छवि के लिए सक्षम होना चाहिए. इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी हो गया है और इन कोलेजन संरचनाओं 19 विशेषताएँ इस्तेमाल किया गया हो सकता है.
इन प्रक्रियाओं के प्रमुख लाभ यह है कि वे मुख्य रूप से उत्पादन वांछित कोलेजन का निर्माण. कोलेजन के अन्य रूप है कि इन प्रतिक्रियाओं में पाया जाता है शुरू monomer, जो अक्सर AFM छवियों की पृष्ठभूमि में दिखाई देता है. देशी और FLS कोलेजन के मामले में, वे आसानी से unrea की सबसे अधिक से अलग किया जा सकता हैदोहराया और जिसके परिणामस्वरूप या पानी के साथ देशी FLS कोलेजन गोली centrifugation धोने से cted monomer.
हम देशी FLS, और कोलेजन SLS उन्नत, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुरू सामग्री का उपयोग करने के लिए आसान और विश्वसनीय प्रक्रिया प्रस्तुत किया है. इन सभी प्रक्रियाओं में प्रयुक्त कोलेजन monomer वाणिज्यिक एक शुद्ध रूप में उपलब्ध है. α1 एसिड glycoprotein और एटीपी भी व्यावसायिक दोनों उपलब्ध हैं.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सभी पिछले कई स्नातक, स्नातक और पोस्ट डॉक्टरेट छात्रों को, जो हमारी प्रयोगशाला में कोलेजन fibrogenesis का अध्ययन करने के लिए अपना समय और प्रयास में योगदान दिया है शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल के लगातार हमारी कोलेजन के अध्ययन के लिए धन उपलब्ध कराया गया है.
Materials
| Material/reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
| ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
| α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
| a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
| mica | Ted Pella | 53 | |
| Pointprobe – Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
| Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |
References
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