Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em> Drosophila</em
Summary
Para comprender un enlace entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento, se describe un método para medir el comportamiento locomotor en<em> Drosophila</em> Durante la infección bacteriana, así como la habilidad de las moscas para montar una respuesta inmune por la supervivencia de seguimiento, la carga bacteriana, y en tiempo real de la actividad de un regulador clave de la inmunidad innata, NFkB.
Abstract
Una compleja interacción entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento del sistema se ha descrito en una amplia gama de especies. Exceso de sueño, en particular, se sabe que ocurre como respuesta a la infección en mamíferos 1 y también ha sido descrito recientemente en Drosophila melanogaster 2. En general se acepta que el sueño es beneficiosa para el huésped durante una infección y que es importante para el mantenimiento de un sistema inmune robusto 3,4. Sin embargo, la evidencia experimental que apoya esta hipótesis es limitada 4, y la función de exceso de sueño durante una respuesta inmune sigue siendo poco clara. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinario para abordar este complejo problema, y se han llevado a cabo estudios en el sistema modelo genético simple, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Nosotros utilizamos un ensayo estándar para medir el comportamiento locomotor y el sueño en las moscas, y demostrar cómo este ensayo se utiliza para medir el comportamiento en las moscas infected con una cepa patógena de las bacterias. Este ensayo también es útil para controlar la duración de la supervivencia de las moscas individuales durante una infección. Medidas adicionales de la función inmune incluyen la habilidad de las moscas para eliminar una infección y la activación de NF-kB, un factor de transcripción clave que es central en la respuesta inmune innata en Drosophila. Tanto los resultados de supervivencia y el aclaramiento de bacterias durante la infección juntos son indicadores de la resistencia y la tolerancia a la infección. Resistencia se refiere a la habilidad de las moscas para eliminar una infección, mientras que la tolerancia se define como la capacidad del huésped para limitar los daños de una infección y por lo tanto sobrevivir a pesar de los altos niveles de patógenos en el sistema 5. Monitoreo en tiempo real de la actividad de NF-kB durante la infección da una idea de un mecanismo molecular de la supervivencia durante la infección. El uso de Drosophila en estos ensayos sencillos facilita los análisis genéticos y moleculares de sueñoy la respuesta inmune y cómo estos dos sistemas complejos están recíprocamente influenciados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un enfoque para investigar cómo el comportamiento, particularmente dormir, está vinculado a los parámetros de la respuesta inmune. Estos parámetros incluyen la carga bacteriana, los resultados de supervivencia, y la actividad de NF-kB, medido por un indicador de luciferasa in vivo. En conjunto, estos parámetros proporcionan información sobre la capacidad de una mosca puede luchar contra una infección. La carga bacteriana y los resultados de supervivencia son parámetros de la resp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation bajo la subvención # IOS-1025627 y por los Institutos Nacionales de Salud, bajo la concesión # 1R21NS078582-01 a MORDAZA
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
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