Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em> Drosophila</em> Retinas
Summary
O<em> Drosophila</emRetina> é uma estrutura cristalina do tipo composto por um pequeno número de tipos de células que são geradas de um modo estereotipado<sup> 1</sup>. Sua receptividade à análise genética sofisticada permite o estudo de complexos programas de desenvolvimento. Este protocolo descreve dissecações e imunohistoquímica de retinas em três distintas fases de desenvolvimento, com foco na diferenciação de fotorreceptores.
Abstract
O olho composto de Drosophila melanogaster é composto por cerca de 750 omatídeos (olhos de unidades). Cada omatídeo é composto de cerca de 20 células, incluindo as células secretoras de lente de cone, as células de pigmento, uma célula de cerdas e oito fotorreceptores (RP) R1-R8 2. A RP têm estruturas especializadas microvilares, os rhabdomeres, que contêm pigmentos sensíveis à luz, os rodopsinas (RHS). Os rhabdomeres de seis PRs (R1-R6) formar um trapézio e conter Rh1 3 4. Os rhabdomeres de R7 e R8 são posicionadas em conjunto no centro do trapézio e partilhar o mesmo caminho de luz. R7 e R8 PRs estocasticamente expressar diferentes combinações de RHS em dois principais subtipos 5: Em subtipo 'p', RH3 em p R7s é acoplado com RH5 em p R8s, enquanto no subtipo do 'y', RH4 em y R7s está associada RH6 em y R8s 6 7 8.
As primeiras especificações de RP e desenvolvimento de omatídeos começa no disco de olhos antenal larval imaginal, uma monocamada de células epiteliais. Uma onda de diferenciação varre o disco 9 e inicia a montagem de células indiferenciadas em omatídeos 10-11. R8 a "célula fundador 'é especificada primeiro e recruta R1-6 e depois R7 12-14. Posteriormente, durante o desenvolvimento pupal, diferenciação PR leva a grandes mudanças morfológicas 15, incluindo a formação rhabdomere, sinaptogênese e expressão eventualmente rh.
Neste protocolo, descrevemos métodos para dissecção da retina e imunohistoquímica em três períodos definidos de desenvolvimento da retina, o que pode ser aplicada para resolver uma variedade de questões relativas à formação da retina e vias de desenvolvimento. Aqui, usamos esses métodos para visualizar a diferenciação PR gradual no nível de uma única célula em toda montagem larval, midpupal e retinas adulto ( <sTrong> Figura 1).
Protocol
Discussion
1. Solução de problemas
Em nossa experiência, dissecções requerem prática (várias semanas) e são facilitados por alcançar uma posição confortável da mão 21 por descansar os cotovelos e antebraços sobre a mesa e com os dedos fazendo contato com o prato dissecção. Dedos Dessa forma, apenas os polegares o índice e meio realizar movimentos sutis.
Remover a lâmina sem danificar os fotorreceptores é provavelmente o passo mais desafiador. Prá…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Ehrman para HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund para a comunhão de Pesquisa Médica de pós-doutorado para RJJ, NIH Grant F32EY016309 para DV, bolsa de Nova York University Dean Dissertação de DJ, NIH GrantR01 EY13010 em CD e uma bolsa DFG a JR (RI 2208/1- 1). Agradecemos Nina Vogt e Pamela Boodram para comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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