Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em> Drosophila</em> Rétines
Summary
La<em> Drosophila</emRétine> est un réseau cristallin de type composé d'un petit nombre de types de cellules qui sont produites d'une manière stéréotypée<sup> 1</sup>. De la perméabilité à l'analyse génétique sophistiquée permet l'étude des programmes complexes de développement. Ce protocole décrit les dissections et immunohistochimie de rétines à trois stades de développement distincts, en mettant l'accent sur la différenciation des photorécepteurs.
Abstract
L'œil composé de Drosophila melanogaster est constitué d'environ 750 ommatidies (yeux unitaires). Chaque ommatidie est composé d'environ 20 cellules, dont les cellules sécrétrices cône lentille, les cellules pigmentaires, une cellule poils et huit photorécepteurs (PR) R1-R8 2. Les bénéficiaires principaux ont des structures spécialisées, les microvillosités rhabdomeres, qui contiennent des pigments sensibles à la lumière, les Rhodopsins (ERS). Les rhabdomeres de six PN (R1-R6) forment un trapèze et contiennent Rh1 3 4. Les rhabdomeres de R7 et R8 sont positionnées en tandem dans le centre du trapèze et partager le même chemin de lumière. R7 et R8 PR stochastique exprimer différentes combinaisons de Rhs en deux sous-types principaux 5: Dans le sous-type 'p', p RH3 en R7s est couplé avec RH5 en p R8S, alors que dans le sous-type 'y', y Rh4 dans R7s est associée à rh6 en y R8S 6 7 8.
Spécification précoce des PR et le développement des ommatidies commence dans les larves des yeux antennaire disque imaginal, une monocouche de cellules épithéliales. Une onde de différenciation balaie le disque 9 et déclenche l'ensemble de cellules indifférenciées en ommatidies 10-11. R8 La «cellule fondateur est spécifiée en premier et recrute R1-6 et R7 12-14. Par la suite, au cours du développement nymphal, la différenciation PR conduit à d'importantes modifications morphologiques 15, y compris la formation rhabdomere, la synaptogenèse et d'expression finalement rh.
Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes déterminées du développement de la rétine, qui peuvent être appliquées pour traiter une variété de questions concernant la formation de la rétine et les voies de développement. Ici, nous utilisons ces méthodes pour visualiser la différenciation progressive proportionnelle au niveau unicellulaire en tout montage des larves, adultes et midpupal rétines ( <strong> Figure 1).
Protocol
Discussion
1. Dépannage
D'après notre expérience, les dissections requièrent de la pratique (plusieurs semaines) et sont facilitées par atteindre une position confortable à la main 21 par reposer les coudes et les avant-bras sur la table et avec les doigts en contact avec le plat de la dissection. De cette façon, les doigts, les pouces seulement, index et le majeur effectuer des mouvements subtils.
Retrait de la lame sans endommager les photorécepteurs e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse Ehrman à HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund pour la recherche médicale postdoctorale bourse de JJR, des subventions du NIH F32EY016309 au format DV, Bourse de Thèse Université de New York doyen de DJ, NIH GrantR01 EY13010 de CD et une bourse de recherche DFG à JR (RI 2208/1- 1). Nous remercions Nina Vogt et Pamela Boodram des commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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