Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

1. Kloon van de therapeutische genen in HDAd Shuttle Vector Kloon muis Ngn3 en Btc cDNAs in de pLPBL1 plasmidevector die een alomtegenwoordige elongatiefactor-1 promoter (BOS) en een poly A signaal bevat. Na voltooiing controleren vectoren door sequentie-analyse en vervolgens subkloneren deze expressiecassettes in pΔ28 HDAd shuttle plasmide 6. Digest HDAd shuttle vectoren met Pmel het plasmide ruggengraat los te zuiveren DNA door fenol / chloroform / isoamylalcohol extractie gevolgd door ethanol precipitatie en reconstitueren met transfectie-grade water. 2. Helper-afhankelijke adenovirale vector Production HDAd vector productie bestaat uit meerdere stappen die zorgvuldig moeten worden gevolgd voor een optimaal resultaat. 2,1 Transfectie Twee dagen voorafgaand aan transfectie zaad 116 cellen 7 in 6-cm schaaltje 70-80% confluent bereikt op de dag van transfectie. Drie uur voor transfectie verwijderen medium en voeg 5 ml vers groeimedium [MEM aangevuld met 10% FBS en 1% PSG (penicilline, streptomycine en glutamine), Invitrogen]. Transfecteren 116 cellen met 10 ug DNA uit stap 1.2), met de ProFectionR Mammalian transfectie kit van Promega volgens de fabrikant. De volgende dag was de cellen met 1 ml groeimedium 2 keer. Voeg helper virus (HV) bij 500 vectordeeltjes (vp) / cel 0,1 ml PBS die calcium en magnesium (PBS + +) en overlay aan de cellen. Schud de gerechten gelijkmatig te verdelen de HV elke 10 minuten. Na 60 min, voeg 1,5 ml van onderhoud medium (MEM, 5% FBS, 1% PSG). Voeg een 1 ml onderhoudsmedium de volgende dag. Let cellen voor CPE (cytopathogeen effect – cellen worden afgerond en vrijstaand). Meer dan 80% van de cellen moet blijken CPE 2 dagen na infectie. Verzamel ruw cellysaat (CVL, cellen en het medium), eendd 10% volume van 40% sucrose en bij -80 ° C. De CVL wordt bestempeld als doorgang 0 – (CVL-P0). 2,2 Vector versterking Freeze (-80 ° C, 3-5 minuten) / ontdooien (37 ° C, 1-2 min) 3 maal. Overlay 0,5 ml CVL aangevuld met HV op 200 vp / cel naar samenvloeiende 116 cellen in 6-cm schotel, en schud de schotel voorzichtig om de 5 minuten. Na 30 min, voeg 1 ml onderhoudsmedium. Voeg 1 ml onderhoudsmedium volgende dag. 2 dagen later, de meeste van de cellen vertonen CPE. Verzamel de CVL en bij -80 ° C (CVL-P1) als beschreven voor stap 2.1.8). Herhaal de procedure voor 3 keer om de CVL P2-P4 te krijgen. DNA extract (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) van 0,2 ml verzameld CVL op P1-P4 en analyseren vector amplificatie door qPCR met HV en HDAd-specifieke primers (tabel 1). Gebruik de passage waarin exponentieel HDAd opzichte HV (P3 in figuur 2) geamplificeerd de subsequent procedure. Co-infecteren 90% confluent 116 cellen in 15cm schotel met 0,5 ml CVL en HV bij 200 vp / cel. Rock de schotel voorzichtig om de 5 minuten. Na 30 min, 10 ml onderhoudsmedium. Voeg 5 ml van het onderhoud medium na 24 uur. Verzamel cellen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 5 min precies 48 uur na infectie. Resuspendeer cellen in 1 ml PBS + + bevattende 4% sucrose (P5) en invriezen bij -80 ° C. 2,3 Grootschalige HDAd productie Tot 116 cellen te voor infectie in suspensie celkweek overdragen confluente 116 cellen in 8 x 15 cm schaal in 3 L centrifugekolf en voeg suspensiegroei medium (Joklik gemodificeerd MEM aangevuld met 5% FBS, 0,1 mg / ml hygromycine en 1% PSG) naar final 1 L, en incuberen in een CO2 incubator met centrifugeren bij 60 rpm 8. Voeg 0,5 L van vers medium elke dag gedurende 2 dagen (totaal 2 L). Reken cellen op de derde dag. Cellen zijn klaar voor gebruik als het bereiken van to totaal aantal cellen van 1×10 9. Vorst / dooi P5 3 keer. Verzamel cellen van 3 L centrifugekolf door centrifugatie bij 1000 xg gedurende 5 minuten. Sla 100 ml supernatant aan resuspendeer de cellen. Breng cellen in een 250 ml centrifugekolf. Voeg P5 en HV bij 200 vp / cel cellen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C bij 60 rpm. Transfer cellen en medium tot 3 L centrifugekolf, voeg 2 L schorsing groeimedium. Breng 1 ml celsuspensie aan een putje in een 12-well plaat aan de cellen gedurende acht CPE. Incubeer cellen in centrifugekolf 2 dagen in een CO2 incubator bij 60 rpm. Verzamel cellen door centrifugeren en resuspendeer met 15 ml 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) en bij -80 ° C (P6) tot de zuivering. 2,4 Vector zuivering Voeg 1,0 ml van 5% natriumdeoxycholaat de P6. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 400 ul van 2 M MgCl2, 300 μl RNase A (10 mg / ml) en 300 ul DNase I (10 mg / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Centrifugeer bij 6000 g gedurende 10 min bij kamertemperatuur te verzamelen supernatant. Steriliseer NVT 65 ultracentrifuge buizen (Beckman) onder UV-licht gedurende 1 uur in weefselkweek kap. Voeg 2,8 ml van lage dichtheid CsCl oplossing (1,25 g / ml), 2,8 ml onderlaag hoge dichtheid CsCl geconcentreerde oplossing (1.41g/ml) en overlay 5-6 ml supernatant aan de buis vullen van de hals. Gebruik 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) op de buis eventueel vullen. Centrifugeer bij 10 ° C gedurende 30 min bij 50.000 rpm bij 10 ° C met Beckman LE-80K met NVT-65 rotor. Veeg het gebied met 70% ethanol voor naaldpunctie, en het verzamelen van de lagere opalescent band met een 3-ml-spuit met 22-G naald elkaar punctie (figuur 3a). Soms is een zeer zwakke helper band is te zien onder de meer prominente vector band. Probeer om zoveel mogelijk van e te verkrijgene vector band mogelijk te maken, zonder dat de helper band. Het is aanvaardbaar voor deze stap zelfs als enkele helper band wordt afgezogen, zoals zal worden gescheiden bij de daaropvolgende nacht centrifugatie die volgt. Plaats de verzamelde bands in een nieuwe gesteriliseerde ultracentrifuge buizen. Vul de buizen naar de nek bedekken 1,35 g / ml CsCl geconcentreerde oplossing. Centrifugeer bij 10 ° C bij 50.000 rpm overnacht. Verzamel de opalescent band (figuur 3b). Breng de band in een dialyse cassette (Slide-a-Lyzer, 10.000 MWCO, Thermo-wetenschappelijke). Dialyseer tegen 3 L geautoclaveerd 10 mM Tis-HCl, pH 7.2, bevattende 2 mM MgCl2 en 4% sucrose bij 4 ° C overnacht. Verwijder de HDAd vector van dialyse cassette. Aliquot 20 ul voor fysieke titer en 50 ul van DNA typering. (Opmerking: Voor Ngn3 vector, herhaalt u "P6" drie keer om voldoende vector te verkrijgen, aangezien de opbrengst van HDAd-Ngn3 is slecht in vergelijking met HDAd-Btc of HDAd-leeg.) 2.5 Karakterisering van HDAd vectoren Bepalen de fysieke titer (vp / ml) met optische dichtheid (OD). Voeg 20 ul vector of 20 ul dialysebuffer tot 380 ui TE buffer die 0,1% SDS en incubeer bij 56 ° C gedurende 20 minuten. OD gemeten bij 260 nm. De fysieke titer = OD260 x 1.1 x 10 12 x 20 (vp / ml). Analyseer HV besmetting door qPCR. Gebruik 50 pl hoeveelheid aan DNA met behulp van DNeasy weefsel / bloed DNA-extractie kit (Qiagen) uit te pakken. Verdunnen DNA 1000-voudig en neemt 5 pl voor qPCR analyse met behulp van helper en vector-specifieke primers (tabel 1). De helper verontreiniging moet minder dan 1%, zoals weergegeven in figuur 4A. Gebruik Southern blot om vector structuur analyseren. Voer Southern blot analyses 10 met een probe voor de inverted terminal repeat (ITR). De vertegenwoordiger resultaat wordt getoond in figuur 4B. Bepalen in vitro werkzaamheid. Infect bekendaantal van 116 cellen in een 12 well plaat met HDAd vector bij 1000 vp / cel in viervoud. Oogst de cellen na 48 uur en extraheer de expressie van RNA en Ngn3 Btc mRNAs bepalen door qRT-PCR (tabel 1). Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 5. 3. Behandeling van diabetische muizen door HDAd-Ngn3 en-Btc 3,1 Inductie van diabetes bij muizen en injectie van HDAd vectoren Voorbereiding van STZ: Bereid 0,1 M citraat buffer, en breng de pH op 4,3-4,5. Filtert door een 0,22 mm spuitfilter. Met behulp van steriel water verdunnen dit tot 0,01 M Na-citraat pH 4,2-4.5. Los geschikte hoeveelheid STZ (Sigma) in deze oplossing tot een eindconcentratie van 12,5 mg / ml te bereiken. Bij deze concentratie geen neerslag. Deze STZ oplossing bij 4 ° C tot gebruik. Breng de temperatuur van het injecteren oplossing op kamertemperatuur vlak voor de injectie. De STZ-oplossing should worden vers bereid elke dag en geïnjecteerd binnen 5-10 minuten van opgelost. Injecteer dit STZ oplossing intraperitoneaal (10 ul / g aan een dosis van 125 ug / g lichaamsgewicht te bereiken), 's avonds tussen 5-7 uur (voordat de lichten worden uitgeschakeld in de muis faciliteit en de muizen beginnen met het voeden actief), op twee opeenvolgende dagen 9. 3.2 Toezicht muizen glucose en injectie van HDAd vectoren. Snel muizen gedurende 6 uur en meet het lichaamsgewicht en de bloedglucose wekelijks tot muizen hebben hyperglycemie (≥ 250mg/dl). Gebruik een One Touch glucometer voor bloed verzameld door de staart afgesneden. Zodra bloedglucose ≥ 250 mg / dl, controleer dan de bloedglucose weer in 48 uur na een 6 uur snel om hardnekkige hyperglycemie en bloedglucose binnen de doelzone voor de behandeling te garanderen: 250-500 mg / dl. Behandel muizen met persisterende hyperglycemie door een enkele intraveneuze injectie van HDAd vectoren via staartader. De totale vector dosis is 6×10 11 vpvoor alle behandelingsgroepen (in 0,25 ml): 5×10 11 vp Ngn3 +1 x10 11 vp Btc voor combinatiegroep; 5×10 11 vp Ngn3 + 1×10 11 VP voor Ngn3 groep, en 1×10 11 vp Btc + 5×10 11 vp lege vector voor BTC-groep en 6×10 11 vp lege vector voor controle groep. Staartader injectie. Zet muizen in Tailveiner weerhouder (TV-150, Braintree Scientific Inc), en het gebruik van warm water om de staart aderen verwijden, het reinigen van de staart met 70% alcohol. Houd de staart onder de injectieplaats tussen duim en wijsvinger van de hand, gebruik dan een andere hand voor injectie. Vóór het injecteren zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit (met 30 1/2 G naald en spuit van 1 ml). Breng de naald en injecteer de vector langzaam. Als de naald in de ader, kan een flash bloed zichtbaar in de naaf van de naald en ook is er geen weerstand tijdens injectie. Na het verwijderen van de naald, houdt u de injectieplaats met een gaasje om het bloeden te stoppen alvorens terug te keren muizen to kooi. Als de naald niet in de ader is er aanzienlijke weerstand tegen injectie en een kleine subcutaan wheal ontstaat. Op dit moment verwijder de naald en probeer het opnieuw op een andere plaats. 3.3 Analyse van effecten van HDAd-Ngn3 + HDAd-Btc behandeling. Monitor 6 uur nuchtere glucose en het lichaamsgewicht eenmaal per week na vector behandeling. Verzamel bloed uit de vena saphena of de staart ader in het been om de 2 weken voor het testen van insuline (Muis Insuline ELISA kit, Mercodia) en leverenzymen (AST en ALT Infinity reagentia, Thermo Scientific) met behulp van commerciële kits. Plaats de muis in een uncapped 50 ml Falcon buis met gaten in het gesloten einde. De muis hoofd is aan het gesloten einde van de buis en staart aan de open zijde van de buis. Om het bloed te verzamelen van het linkerbeen, het uitbreiden van het linkerbeen buitenkant van de buis en voorzichtig neem de huid van de dij tussen de duim en wijsvinger om het been te immobiliseren. Gebruikeneen scheerapparaat om de haren te verwijderen uit het scheenbeen / onderbeen gebied, de saphena ader, die aanwezig is op de laterale zijde van het onderbeen bloot. Reinig de geschoren huid met 70% alcohol en laat het drogen. Prik de vene met een 25 gauge naald, verzamelen het bloed met Microvette CB300 buis (Sarstedt) en zet de buizen op het ijs. Druk op de prikplaats met een gaasje om het bloeden te stoppen voordat het retourneren van de muizen om de kooien. Centrifugeer de buisjes bij 3000 xg gedurende 5 min, nemen de supernatant en bij -20 ° C voor verdere analyse. 3,4 Voer glucosetolerantietest (GTT) 6 weken na de behandeling. Opgelost D-glucose (Sigma) in gedestilleerd water tot 15% glucose (15 g / 100 ml) en steriel filter de glucose maken. Snelle muizen gedurende 6 uur. Gebruik warm pad om de muizen warm en het bloed (0 min tijdstip) te verzamelen. Vervolgens injecteert 1,5 g / kg D-Glucose ip (10 ul / g van 15% glucose). Colteer bloed bij 15, 30, 60, 120 min. Meet de glucose en insuline in al deze monsters. 3,5 Tissue analyse om de expressie van de vectoren te beoordelen en te evalueren de inductie van eilandje neogenese. In al deze stappen controles die nodig zijn om een ​​betrouwbare interpretatie van de resultaten omvatten: (1) Empty vector behandelde diabetische muizen (2) niet-diabetische muizen en (3) niet-diabetische pancreas die als positieve controle voor de expressie van het eilandje hormonen en specifieke transcriptiefactoren. Oogst lever en pancreas na 3 en 6 weken na de behandeling. Verdelen in twee stukken, het eerste voor snap invriezen in vloeibare stikstof en opslag bij -80 ° C voor RNA en eiwit-extractie en de tweede een nacht vast met 10% formaline voor immunohistochemie analyse. Extract RNA door een standaard protocol en analyseren uitdrukking van eilandje specifieke hormonen en transcriptionele factoren, samen met Ngn3 en de BTC om bevestigingm vector expressie, in de lever door qRT-PCR met behulp van specifieke primers 9, 10. Extraheren insuline en C-peptide uit de lever door zuur-ethanol extractiemethode en kwantificeren door een commerciële ELISA kit (ultra gevoelige Insulin assay, Mercodia, C-peptide ELISA kit, Wako). Voer voor immunokleuring islet bepaalde hormonen (insuline, glucagon, PP, SST) met eilandje transcriptiefactoren in paraffine ingebedde coupes 9, 10. De expressie van Ngn3 en BTC kan ook worden bevestigd door immunokleuring. 4. Representatieve resultaten We gekloond Ngn3 en Btc cDNA in pΔ28 vectoren gedreven door alomtegenwoordige promotor eIF2a (BOS) en behaalde HDAd-Ngn3 en HDAd-BTC. Zoals getoond in figuur 2, relatieve HV contaminatie significant af (hetgeen meer vector amplificatie en minder helper amplificatie) bij passage 3. Daarom gebruikten we P3 vector voor daaropvolgende productie. Na de eersteCsCl discontinue gradiënt ultracentrifugatie en verzamelden we de laagste vector band en worden verzameld opalescent band overeenkomend met HDAd vector in de tweede ultracentrifugatie (figuur 3). Het gezuiverde HDAd vector was minder dan 1% van HV verontreiniging (Figuur 4A) door qPCR en had geen helper verontreiniging zichtbaar Southern blotting (Figuur 4B), voldoende kwaliteit vector infusie in muizen. Verdere analyse opgenomen transgenexpressie door infectie van 116 cellen. De mRNA expressie van Ngn3 en Btc hoger in vector geïnfecteerde cellen door meer dan 10.000 maal vergeleken met die van niet-geïnfecteerde cellen (Figuur 5). HDAd-and-Ngn3 Btc werden toegediend aan STZ-geïnduceerde diabetische muizen via staartader injectie met lege vector geïnjecteerd en HDAd-Btc diabetische muizen geïnjecteerd dient als negatieve controle. Hyperglykemie werd omgekeerd en glucose-gestimuleerde insuline secretiewerd hersteld bij muizen behandeld met zowel HDAd-Ngn3 en HDAd-BTC maar niet bij muizen die met enkel gen vector of controle lege vector (Figuur 6). De HDAd-Ngn3-Btc behandeling geïnduceerde eilandje neogenese en dit werd gekwantificeerd door het bepalen totale insuline en C-peptide inhoud (figuur 6E) met niet-diabetische, diabetische lege vector behandelde muizen dienen als controles. De aanwezigheid van c-peptide en insuline in equimolaire verhoudingen bevestigt dat de insuline wordt gedetecteerd in de lever inderdaad wordt gesynthetiseerd in de lever. RT-qPCR bevestigd dat de lever van HDAd-Ngn3-Btc behandelde muizen alle eilandje-specifieke hormonen en transcriptiefactoren 9 uitgedrukt. Immunohistochemie insuline positieve cellen vertoonde in de lever van muizen behandeld met HDAd-Ngn3 en HDAd-BTC, maar geen insuline positieve cellen waargenomen in muizen behandeld met controle vector (Figuur 7). We hebben ook bevestigd dat er geen resterende eilandjes in de alvleesklier van de Ngn3-Btc treated muizen in vergelijking met de vele eilandjes in niet-diabetische pancreas. Vector (Ngn3 en Btc) met eilandje specifieke lineage transcriptiefactor (Pdx-1 en Nkx6.1) expressie werd ook beoordeeld door immuunkleuring van de lever (Figuur 7). Figuur 1. Stroomdiagram gentherapie van diabetische muizen met helper-virus afhankelijke systeem. Ten eerste, Ngn3 en de BTC, in een cassette aangedreven door een alomtegenwoordige BOS promotor, worden gekloneerd in HDAd naar het vliegveld (pΔ28) vectoren. HDAd wordt geproduceerd door verscheidene stappen, inclusief transfectie, seriële passages van amplificatie en grote schaal infectie gevolgd door zuivering vector. Na het karakteriseren van de kwaliteit, zijn HDAds intraveneus geïnjecteerd in STZ-geïnduceerde diabetische muizen via staartader. De effecten van behandeling worden bepaald door het meten glucose, lichaamsgewicht GTT en analyse van genexpressiein de lever. Figuur 2. Bepaling HDAd vector amplificatie. DNA wordt geëxtraheerd uit passage P0 tot P4 met DNA extractie kits (Qiagen). DNA wordt verdund 1.000-voudig en 5 ul DNA wordt gebruikt voor real-time PCR (qPCR). Helper en vector-specifieke primers gebruikt. Standaardcurven gegenereerd door seriële verdunningen (10 -5 op 1 ng / ml) van HDAd shuttle vector plasmide en HV plasmide (bovenste panelen). Met de standaard curves en de Ct waarden voor de vector en helper virus kopienummer wordt berekend en de verhouding HDAd / HV is uitgezet als een percentage van het totale virus (+ helper HDAd). Vandaar relatieve vector amplificatie wordt berekend als: [vector kopienummer / (vector + helper virus kopienummer)]. In het voorbeeld (onderste paneel) HDAd vector versterking vlakten op P4, terwijl de relatieve HDAd / HV neemt toe op P3. Daarom P3 is geselecteerd voor de volgende stap. Figuur 3. Vertegenwoordiger HDAd vector bands na discontinue CsCl dichtheid ultracentrifugatie. HDAd vector wordt gezuiverd uit een 3 liter spinner cultuur in een aantal achtereenvolgende CsCl dichtheidsgradiënt. (A) eerst dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, een opalescente vector band zichtbaar (pijl) onder opaque celresten (CD). De opaalachtige band (pijl) wordt verzameld voor de tweede dichtheidsgradiënt centrifugeren. (B) Na de tweede dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, wordt de opalescent band (pijl) verzameld voor dialyse. Figuur 4. Analyse van helper virus contaminatie. DNA wordt uit 50 pl gezuiverd virus en helper verontreiniging is eenssessed zoals in figuur 2. De figuur toont helper verontreiniging van HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc minder dan 1%. Figuur 5. Analyse van de structuur van HDAd vector. Southern blot uitgevoerd zoals eerder beschreven (Oka K, et al..). Laan 1: DNA van helpervirus, Laan 2: DNA van P3, Lane 3: DNA van P4, Lane 4: gezuiverde vectopr. Open pijlen geven de helper virus afgeleide groepen en de gevulde pijlen de ITR bands uit de HDAd vector. Figuur 6. Expressie niveau van Ngn3 of Btc in 116 cellen geïnfecteerd met HDAd-Ngn3 of HDAd-Btc vector. 116 cellen in een 12 well platen zijn geïnfecteerd met HDAd-Ngn3 of HDAd-Btc of lege vector bij 1000 vp / cel voor 2 dagen. CeLLS worden geoogst en totaal RNA wordt met behulp van Trizol reagens. qRT-PCR wordt uitgevoerd met behulp Ngn3-of BTC-specifieke primers. De relatieve Ngn3 of Btc mRNA expressie met meer dan 10.000 maal in cellen geïnfecteerd met HDAd-Ngn3 of HDAd-Btc. Het cijfer is overgenomen uit Dev.Cell 2009 Mar; 16 (3): 358-73; Yechoor et. al.., met toestemming van Elsevier. Figuur 7. Genoverdracht van HDAd-Ngn3 en HDAd-BTC in STZ-geïnduceerde diabetische muizen leidt tot omkering van diabetes en inductie van eilandje neogenese in de lever. (A) Plasma glucose en (B) lichaamsgewicht van STZ-geïnduceerde diabetische muizen behandeld met HDAd-Ngn3 en HDAd-Btc. (C) Plasma glucose en insuline in een IP-GTT 6 weken na de behandeling. (D) Representative insuline kleuring in de lever 12 weken na de behandeling. * P <0,05 (vs lege vector groep). Het cijfer is overgenomen uit Dev. CelL 2009 Mar; 16 (3): 358-73; Yechoor et al., met toestemming van Elsevier.. naam forward primer reverse primer helper GACCATCAATCTTGACGACC ATGTCGCTTTCCAGAACCC vector TTGGGCGTAACCGAGTAAG ACTTCCTACCCATAAGCTCC Ngn3 AAGAGCGAGTTGGCACTCAG TCTGAGTCAGTGCCCAGATG Btc GCACAGGTACCACCCCTAGA TGAACACCACCATGACCACT Tabel 1. Primer sequenties.