Summary

ヒト胎児脳から由来オリゴデンドロサイト前駆細胞培養システム

Published: December 20, 2012
doi:

Summary

プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖<em> in vitroで</em>ニューロンおよびアストロサイトに分化する能力を維持しています。この作品は、神経前駆細胞がselect増殖因子とコンディショニングによってoligodendrocytic系統の段階を経て分化誘導することができることを示しています。

Abstract

神経細胞とグリア細胞型へのヒト神経前駆細胞の分化は、神経細胞系譜開発の分子調節を研究し、比較するためのモデルを提供しています胎児の中枢神経系組織からの神経前駆細胞 in vitro の展開では 、十分に特徴付けされています。種々の培養条件の成人ヒト皮質下白質と開発からオリゴデンドロサイトを産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化に直接グリア前駆細胞の同定および単離にもかかわらず、in vitroの実験 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを獲得することは依然として困難である。ガラクトセレブロシドの分化+(GalC)及びO4 +神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト前駆体または前駆細胞(OPC)の妊娠中期胎児の脳を使用して報告されている。しかしながら、これらの細胞はアストロサイトとニューロンを含む支持細胞の非存在下で増殖しないし、文化の中で時間をかけて迅速に失われる。必要性 、in vitro 実験適したオリゴデンドロサイト系譜の細胞を産生する培養システムのために残してあります。

初代ヒトオリゴデンドロサイトの培養は、例えば、 生体内でそれらの細胞に感染し、ヒトポリオーマウイルス、JCVのような神経親和性感染因子の病因を研究するための有用なモデルである可能性があります。これらの培養細胞は、中枢神経系(CNS)の他の脱髄疾患のモデルを提供することができます。神経細胞(前駆細胞由来のニューロンは、PDN)とアストロサイトに分化する能力を維持しながら、プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性神経前駆細胞をin vitro 増殖(前駆細胞由来アストロサイト、PDA)、本研究では、神経前駆細胞を誘導できることを示していますoligodendrocytic系統の発展段階(前駆由来オリゴデンドロサイトは、PDO)の多くを介して区別することができます。 DMEM-F12無血清培地中で私たちの文化の神経前駆細胞はsup塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、血小板由来増殖因子(PDGF-AA)、ソニックヘッジホッグ(Shh)、神経栄養因子(NT-3)、N-2とトリヨードサイロニン(T3)とで可能です。培養細胞は、およそ7日ごとに75センチメートルフラスコあたり2.5e6細胞で継代されています。これらの条件を用いて、培養中の細胞の大多数は少数のプロセスとそのようなA2B5およびO-4などの事前オリゴデンドロサイト細胞の急行マーカーによって特徴形態を維持。我々は4つの成長因子(GF)(bFGFは、PDGF-AA、Shhを、NT-3)を削除し、PDNからの馴化培地を追加すると、細胞は、GalCおよびミエリンなどのオリゴデンドロサイト分化の特定の複数のプロセスおよびエクスプレスマーカーを取得するために開始塩基性タンパク質(MBP)。我々は、オリゴデンドロサイトのユニークなマーカーを同定するために多色フローサイトメトリーを用いて表現型の特性評価を行った。

Protocol

注:神経前駆細胞とoligodendrocytic系統細胞の培養ルーチンについては、インキュベーションを37℃で加湿した5%CO 2雰囲気で行った。 2日毎に、培地は、培養40〜70%コンフルエントであれば、新鮮な培地の50〜100%を使用して置き換えられます。近くコンフルエントの時点では、培養は通常、毎週のスケジュール上で2-2.5e6/T75フラスコで継代されています。 <p class="jove_tit…

Representative Results

それは70%-80%コンフルエント神経前駆細胞培養( 図1A)から分化プロセスを開始することが非常に重要です。多くの細胞は、それが特定の成長因子が含まれているため、前駆細胞からオリゴ培地に培地を変更した後に消えてしまうでしょう。これはoligodendrocytic表現型にコミットされていない神経前駆細胞の増殖は新しい媒体( 図1B)によってサポートされないこと…

Discussion

このプロトコルは、初代ヒト神経前駆細胞から胎児オリゴデンドロサイトを導出し、フローサイトメトリーと免疫蛍光染色の両方を使用して、その表現型を特徴付ける方法について説明します。胎児の中枢神経系から神経前駆細胞の拡大と成長は非常によく、1から4に記載されいる。しかし、in vitro 実験 、人間のために十分なオリゴデンドロサイト…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国立衛生研究所(NIH)、NINDSにおける学内研究プログラムによってサポートされていました。著者は、編集を手伝って顕微鏡とパメラCのふるいで助けるために分子医学と神経科学、リック·ドレイファスの研​​究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Final concentration
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI
Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.

Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500)
Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000)
Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)
Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100)
Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10)
Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.

References

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D’Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
check_url/fr/4274?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).

View Video