환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

다음 프로토콜은 하나의 microtube 장치의 생산을위한 것입니다. 1. 핼로이사이트 나노튜브 솔루션의 작성 Sonicate (10-13 W (RMS)) 250 μL 핼로이사이트 나노튜브 용액 (물 6.6 wt %)를 30 초. 일단 찬물를 반복 sonication과 쿨 솔루션입니다. 또 시원한 시간을 보내세요. 주사기로 sonicated 솔루션을 그려, 0.45 μm의 주사기 필터를 장착하고, 깨끗한 microfuge 튜브에 필터 솔루션입니다. 균질성 유지를 위해 때때로 소용돌이 솔루션입니다. 2. 핼로이사이트 나노튜브와 Microtube 내부 표면의 코팅 50cm에게 마이크로 Renathane microtubing 오랜 섹션 (300 μm의 내경, 35.3 μL 내부 볼륨)을 구합니다. 대각선에서 microtube의 한쪽 끝을 잘라 작은 IDEX 어댑터 부분에 삽입합니다. microtube의 다른 쪽 끝을으로 10분의 3 CC 29G 주사기 바늘을 삽입합니다. microtube를 청소하려면 microtube의 열린 끝을 (최종 배치어댑터 포함) 70 % 에탄올과 추첨으로 ~ 주사기로 50 μL 에탄올은 microtube를 채울 수 있습니다. 주사기로 증류수의 풍부한 볼륨을 그림으로써 microtube의 여지없이 에탄올을 씻어. microtube에서 주사기를 분리, 주사기를 비울 다음 microtube에 다시 첨부. 0.02 % 물에 W / V 폴리-L 라이신의 솔루션을 준비합니다. microtube에 50 μL를 그려 및 실온 (RT)에서 5 분 동안 앉을 수 있습니다. microtube에 100 μL 여과 나노튜브 솔루션을 그리기 및 RT에서 3 분 동안 품어 수 있습니다. 나노튜브 용액을 헹굴 수있는 microtube를 통해 100 μL 물을 긷다. RT에서 밤새, 물 가득, 앉으 코팅 microtube를 허용합니다. 3. 세포 분리를위한 Microtubes의 작성 1X Dulbecco의 인산 10 μg / ML 단백질 G의 솔루션을 준비는 (- 7.2 PBS, 산도 7.0) 염분 버퍼. microtube를 통해 50 μL PBS를 그려 후 50 μL를 그려단백질-G 솔루션과 RT에서 1.5 시간 동안 품어 수 있습니다. 5 μg / ML E-selectin-IgG와 PBS에서 50 μg / ML 항체 (대부분의 암 샘플, 안티 PSMA 전립선 암 샘플 안티 EpCAM)를 포함하는 솔루션을 준비합니다. microtube에 E-selectin과 항체 용액 50 μL를 그려 및 RT에서 2 시간 동안 품어 수 있습니다. 특이 현상이 세포 접착은 5 %의 우유 단백질로 차단됩니다. 5% (W / V) PBS의 우유 단백질의 솔루션을 준비합니다. microtube에 50 μL 우유 단백질 솔루션을 그리기 및 RT에서 1 시간 동안 품어 수 있습니다. 튜브에 50 μL PBS를 그려과 혈액이나 버피 코트 샘플들이 처리를위한 준비가 될 때까지 RT에 둡니다. 이전의 고립을 위해 microtube를 사용하여 최대 10 분, selectin 분자를 활성화하기 위해 칼슘 2 + ( "PBS +")로 포화되어 50 μL PBS를 그립니다. 4. 세포 분리를위한 샘플 준비 환자에서 heparinized로 10 ML 혈액을 그리기 또는 취득튜브. 50 ML 원심 튜브에 장소 10 ML Ficoll-Paque 림프구 절연 솔루션입니다. Ficoll 위에 부드럽게 층 10 ML 전체 혈액, 너무 혈액과 Ficoll를 섞어 없습니다. ° C에서 최소한의 감속 4 개의 15 분 2000x g에서 원심 분리기. 새로운 튜브 버피 코트 레이어와 장소를 제거합니다. PBS로 씻으 버피 코트 (10 분 230x g에서 원심 분리기, 뜨는을 버리고). 부드럽게 한 ML RBC의 용해 완충액으로 세포를 resuspend하고 적혈구를 lyse 위해 RT에서 10 분 동안 품어. 10 ML PBS, 부드럽게 섞어, 10 분 230x g에서 원심 분리기를 추가합니다. 뜨는을 취소하고 부드럽게 4 ML PBS +로 3 펠렛을 resuspend. 5. 세포 분리 IDEX 어댑터를 사용하여 5 ML에 주사기로 작용 microtube의 한쪽 끝을 연결합니다. 주사기 펌프에 주사기를 삽입합니다. 세포 suspensio로 잠수함 작용 microtube의 열린 끝을N. 1-4 ML / H의 microtube를 통해 세포 현탁액을 처리합니다. PBS가 들어있는 튜브에 microtube의 열린 끝을 전송 +와 microtube에서 언바운드과 느슨하게 묶인 세포를 제거하는 0.016 ML / 분에서 주사기로 300 μL PBS +를 그립니다. 깨끗한 튜브에 microtube의 열린 끝을 놓으십시오. microtube에서 주사기를 분리하고 Accutase 함께 prefilled 주사기를 첨부합니다. 부드럽게 채울 microtube (~ 50 μL)로 충분한 Accutase을 perfuse 10 분 RT에서 품어 수 있습니다. 수집, microtube 개를 1 성장 미디어의 ML (79 % RPMI, 20 % FBS, 1 % 페니실린의 스트렙토 마이신)과 perfuse 함께 prefilled 주사기를 첨부하여 조직 문화에 대한 방류수는 플레이트 잘 취급. 37 문화 세포 ° C와 humidified 조건 하에서 5퍼센트 CO 2. 6. 대표 결과 이 기법의 목적은 암 환자의 혈액에서 가능한 암 세포를 분리하는 것입니다. 방법은 여러 문화에 암세포를 식별하는 존재, 장치의 성공 필수 확인합니다. 우리는 그대로 세포 핵 (그림 2 및 3)을 식별하기 위해 DAPI 이외에 같은 EpCAM (상피 세포 유착 분자) 또는 PSMA (전립선 특정 막 항원)와 같은 상피 moieties에 대한 항체와 문화의 세포를 얼룩을 선택하셨습니다. 암 세포의 숫자는이 기술을 사용하면 필연적으로 시작하는 샘플에서 CTCs의 개수의 함수이며, 환자 다양성이 높은가 될 수 캡처. 단계 IV는 암 진단을 환자에서 가져온 샘플을 처리에서 우리는 정기적으로 purities에서 혈액 튜브 당 100 사이 500 암세포,> 50 %를 캡처. 즉시 격리 따라 오염 leukocytes의 큰 숫자가 나타날 수 있습니다. 그러나이 숫자는 최대 5 일 동안 배지에서 다음과 인큐베이션을 고갈됩니다. <st룽> 그림 1. 항체 – 매개 정적 유착이어서 selectin-매개 압연을 보여주는 CTC 절연에 대한 작용 microtube의 도식. 그림 2. 혈액 샘플에서 CTC 절연 대표 데이터는 유방암 환자 및 폐암 환자에서 가져온. CTC는 EpCAM의 염색법을 바탕으로 적극적으로 식별 가능한 세포의 수는 CTC가 촬영한 세포의 총수에 비해 고체 바 왼쪽 종좌표 및 확인되었습니다 세포의 비율과 관련된 대변하는 열린 막대로 표시되며 오른쪽 종좌표을 측정했습니다. 결과 문화 5 일 따르고 있습니다. isolati에 오일 후속 문화 CTC 별도의 기증자 (A와 B)에서 그림 3. 대표 micrographs암 환자 혈액 채취부터. 세포 fluorescently 핵 (파란색)를 시각화하는 AlexaFluor 488 (녹색) 및 4 ', 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 EpCAM위한 물들어 있었다.