रोगी के रक्त के नमूने से व्यवहार्य परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं का तेजी से अलगाव
Summary
घूम ट्यूमर कोशिकाओं सेलुलर क्षति inflicting के बिना कैंसर के रोगियों के रक्त से अलग कर रहे हैं. ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव उपकला मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए इसके अलावा में ई selectin के bimolecular सतह का उपयोग कर पूरा किया है. एक नैनोट्यूब कोटिंग विशेष रूप से कैंसर कोशिका आसंजन उच्च कब्जा purities में जिसके परिणामस्वरूप को बढ़ावा देता है.
Abstract
Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of >50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.
Protocol
Discussion
यह अक्सर मामला है कि नए कैंसर चिकित्सा विज्ञान की खोज में जल्दी कदम कैंसर कोशिका लाइनों, जो प्राथमिक कैंसर की कोशिकाओं को संदिग्ध सादृश्य भालू का उपयोग अभी तक प्रयोगशाला में उपयोग के अपने आसानी के कारण का उपयोग में रहते है. नए कैंसर के उपचारों के विकास में अनुसंधान अगर प्राथमिक मानव कैंसर कोशिकाओं उपन्यास शोध के शुरू में उपयोग किया गया शीघ्र किया जाएगा. सीटीसी कैंसर कोशिका की सबसे आसानी से सुलभ प्रकार, जिससे रक्त में इनकी उपस्थिति और एक मानक रक्त ड्रॉ की आसानी के कारण कर रहे हैं. इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी 5,6 मेटास्टेसिस की प्रक्रिया में एक आवश्यक कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं, तो उनके रोग और नई दवाओं को लक्षित करने के लिए उपयोगिता के लिए प्रासंगिक स्पष्ट है. सीटीसी इन विट्रो में खून से अलगाव उनके कम मात्रा द्वारा जटिल है: प्रति एक लाख leukocytes या एक अरब 7 एरिथ्रोसाइट्स प्रति के आदेश पर. रक्त में सीटीसी का पता लगाने के केवल तकनीक एफडीए को मंजूरी दी सेल सहित, के लिए मौजूदा तरीकों के बहुमत खोज (Veridex) क्षति, या पता लगाने की प्रक्रिया में कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए, गणना से परे उपयोग precluding. विधि सेल व्यवहार्यता समझौता नहीं ऊपर वर्णित है और इस तरह कैंसर पर भविष्य नैदानिक अनुसंधान के लिए दरवाजे खोलता है. बरकरार कोशिकाओं की वसूली के रूप में इस तकनीक का लक्ष्य है, यह जरूरी है कि कोशिकाओं को रक्त जुदाई चरणों के दौरान विशेष रूप से, ध्यान से संभाला जा है.
वहाँ है कि कैंसर के प्रकार के रूप में महत्वपूर्ण विशेषताओं के आधार पर सुधार उपज प्राप्त करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है इस प्रणाली में ट्यून करने योग्य मानकों के एक नंबर रहे हैं. ऊपर वर्णित चरणों में, हम जब प्रोस्टेट कैंसर के नमूने के प्रसंस्करण को छोड़कर सभी प्रकार के कैंसर के लिए एक CTC-विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में EpCAM उपयोग करने के लिए, जिसमें विरोधी PSMA इस्तेमाल किया गया था चुना था. कैंसर विशिष्ट एंटीबॉडी के आगे substitutions निश्चित रूप से व्यक्ति के रोगियों के लिए प्रदर्शन में सुधार किया जा सकता है. इसके अलावा, selectin और प्रतिरक्षी सांद्रता 8 कब्जा बढ़ाने के लिए बदल सकता है.
"> डिवाइस का एक अनिवार्य विशेषता सतह पर ई selectin अणुओं का समावेश ई selectin है. आम तौर पर endothelial कोशिकाओं और सूजन की साइटों के लिए तेजी से बढ़ leukocytes भर्ती समारोह की luminal सतह पर व्यक्त की है. की ओर बहने वाली leukocytes transiently बाँध selectin अणु, एक धीमी, रोलिंग व्यवहार है कि धीमी और मजबूत सेल की integrins द्वारा endothelium के लिए बाध्य की सुविधा में जिसके परिणामस्वरूप. कायल प्रयोगात्मक सबूत मौजूद है कि मामला है कि सीटीसी एक समान 9,10 तंत्र द्वारा बहना कर सकते हैं बनाता है selectin का समावेश भी है. युक्ति अधिक प्रवाह दरों पर संचालित करने के लिए अनुमति देता है, दर है कि अन्यथा 11 एंटीबॉडी के लिए बाध्य करने से कोशिकाओं को रोका जा सके. इस प्रकार हमारे युक्ति physiologically biomimetically सेलुलर चोट inflicting के बिना सीटीसी बह कब्जा venule mimics है.बढ़ी युक्ति प्रदर्शन halloysite नैनोट्यूब कोटिंग की luminal सतह के लिए इसके अलावा करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता हैडिवाइस के. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि वहाँ नैनोट्यूब कोटिंग है कि बेहतर कार्यक्षमता के लिए अनुमति देता है के तीन प्रमुख घटक हैं. सबसे पहले, नैनोट्यूब कोटिंग बढ़ सतह क्षेत्र प्रदान करता है, सतह 4 पर अधिक से अधिक प्रोटीन बयान के लिए अनुमति देता है. दूसरा, हम नैनोट्यूब कोटिंग पर परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन में निर्धारित किया है कि व्यक्तिगत नैनोट्यूब प्रवाह में सतह से बहर. यह selectin अणुओं को सतह से ऊपर के रूप में ज्यादा के रूप में एक माइक्रोन प्रस्तुत किया ताकि कोशिकाओं और कब्जा कर लिया जा सकता है की सतह के लिए 4 ट्यूब के माध्यम से पहले उनके प्रक्षेपवक्र में भर्ती की अनुमति देता है. अंत में, halloysite नैनोट्यूब कोटिंग करने के लिए ल्युकोसैट आसंजन को रोकने के लिए और सतह पर फैल, सीटीसी के साथ कब्जा कर लिया leukocytes के एक कम संख्या के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार अधिक से अधिक बाद सीटीसी 3 purities करने में सक्षम है.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्णित काम Microenvironment और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से पुरस्कार U54CA143876 संख्या के माध्यम से मेटास्टेसिस पर कॉर्नेल केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं. इस काम के अतिरिक्त एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (ADH) द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific | MRE025 |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health & Science | 1507L |
| 5mL syringe for pump | BD | 309603 |
| Connector small to large tubing | IDEX Health & Science | P-770 |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health & Science | F-120 and P-659 |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2′) | BD | 309301 |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 |
| PSMA Antibody (GCP-04) | abcam | ab66911 |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Falcon | 35-3072 |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad Laboratories | 216005508 |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 22400-089 |
| DPBS | Gibco | 14190-095 |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
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