مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف
Summary
ويخضع اللحمة المتوسطة الجمجمة الحركات المثيرة التي توفر morphogenic المرجح قوة دافعة للارتفاع طيات العصبية<sup> 1،2</sup>. نحن هنا وصف بسيط<em> خارج الجسم</em> يزدرع مقايسة لتوصيف سلوكيات الخلوية من خلال اللحمة المتوسطة الجمجمة تكون العصيبة. هذا الاختبار لديها العديد من التطبيقات بما في ذلك كونها قابلة للتلاعب الدوائية والتحليلات التصوير الحية.
Abstract
ويستمد الجهاز العصبي المركزي من لوحة العصبية التي تمر سلسلة من الحركات المعقدة تخلقية مما أدى إلى تشكيل الأنبوب العصبي في عملية تعرف باسم تكون العصيبة. تكون العصيبة أثناء، ويعتقد التشكل من اللحمة المتوسطة والذي أدى إلى لوحة العصبية لدفع أضعاف الارتفاع العصبية. وتتألف الجمجمة من اللحمة المتوسطة الأديم المتوسط مجاور للمحور والخلايا العصبية قمة. خلايا اللحمة المتوسطة شكل الجمجمة وشبكه pourous يتألف من خلايا النجمية الشكل والاختلاط خارج الخلية المصفوفة (ECM) التي تدعم مسارات طيات العصبية. تكون العصيبة خلال واللحمة المتوسطة الجمجمة يخضع النمطية مما أدى إلى إعادة ترتيب توسعها ويعتقد هذه الحركات لتوفير قوة دافعة للارتفاع أضعاف العصبية. ومع ذلك، لا تزال سيئة درس المسارات الخلوية والسلوكيات التي تدفع الجمجمة التشكل اللحمة المتوسطة. التفاعلات بين ECM وخلايا اللحمة المتوسطة تسا الجمجمة underlyالسلوكيات ه الخلية. نحن هنا وصف فيفو السابقين بسيطة مقايسة يزدرع وضعت لوصف سلوك هذه الخلايا. هذا الاختبار هو قابلة للتعديل لتلاعب الدوائية لتشريح إشارات الممرات المشتركة والتحليلات التصوير الحي لوصف سلوك مزيد من هذه الخلايا. نقدم تجربة ممثل مما يدل على فائدة هذا الاختبار في تشخيص خصائص المهاجرة من اللحمة المتوسطة الجمجمة على مجموعة متنوعة من المكونات ECM.
Introduction
إغلاق أنبوب العصبي في المنطقة الجمجمة يحدث بين 8.5 يوم الجنينية (E8.5) و 9.5 في جنين فأر. فشل لإغلاق الأنبوب العصبي بشكل صحيح في نتائج الرئيسي في انعدام الدماغ، وهو عيب خلقي شائع في البشر والهيكلية غير متوافق مع الحياة. يتم إنشاء القوات التي تدفع رأسي إغلاق الأنبوب العصبي من الأنسجة العصبية نفسها على حد سواء والبشرة المحيطة بها واللحمة المتوسطة 3. في التوسع معينة من اللحمة المتوسطة الجمجمة يعتقد أنه ضروري لرفعة لل1،2 أضعاف العصبية الجمجمة. واللحمة المتوسطة الجمجمة غنية في البروتينات البروتينات في الغليكوزيلاتي ECM معينة مثل كبريتات الهيبارين بروتيوغليكان، الكبريتات شوندروتن و 4-8 هيالورونات.
خلافا لما حدث في جنين الدجاج حيث الخلايا العصبية قمة الهجرة من الأنبوب العصبي الظهري بعد إغلاق الأنبوب العصبي، وقمة العصبية في جنين فأر يهاجر في نفس الوقت أن نبدأ في طيات العصبية صISE (بعد مرحلة الجسيدة 5). وبالتالي تكون العصيبة خلال الماوس في الجنين، ويتكون من الجمجمة اللحمة المتوسطة الخلايا المشتقة من قمة العصبية الأديم المتوسط ومجاور للمحور. هي التي يسببها قمة العصبية الأديم المتوسط مجاور للمحور والسكان في أوقات مختلفة في التنمية؛ المترجمة في مواقع مختلفة في الجنين وتطوير في الهياكل المختلفة 9،10. والأديم المتوسط مجاور للمحور تنبع من خط البدائية ويهاجر إلى المنطقة الأمامية من الجنين لوحة تكمن وراء المفترض العصبية. هو فعل قمة العصبية عند تقاطع العصبية لوحة الأديم الظاهر والبشرة، ليخضع لالظهارية اللحمة المتوسطة والانتقال delaminates قبيل الارتفاع أضعاف العصبية في الأجنة القوارض. الخلايا العصبية قمة على طول مسارات الهجرة النمطية في الأديم المتوسط مجاور للمحور تحت الأديم الظاهر إلى قوس خيشومي، الجبهية الأنفية واللحمة المتوسطة المحيط بالعين. الأديم المتوسط مجاور للمحور فإن المساهمة في بعض من عظام الجمجمة قبو والعضلات في الوجه، أما الوه العرف العصبي تسهم في عظام الجمجمة أخرى من وجهه بالإضافة إلى الأعصاب القحفية 9-11. ويمكن للالأديم المتوسط مجاور للمحور والأنساب قمة العصبية تتميز بشكل مختلف من قبل لجنة المساواة العرقية، وMesp1 Wnt1-خطوط الماوس المعدلة وراثيا لجنة المساواة العرقية، على التوالي 9.
وقد يستدل على الدور الأساسي للاللحمة المتوسطة الجمجمة في إغلاق الأنبوب العصبي من حيث التجارب علاج الأجنة القوارض مع ECM تعطيل عوامل مثل هيالورونيداز، chondroitinase ABC، heparitinase أو ديازو OXO نورلوسين-(DON) خلال ضعاف تكون العصيبة إغلاق الأنبوب العصبي 7، 12-14. في هذه التجارب، وكشف التحليل النسيجي للأقسام ثابتة بعد dysmorphogeneis تكون العصيبة المرتبطة من اللحمة المتوسطة الجمجمة 7،12-14. ومع ذلك، منذ كان وكيل ماسخة الوصول إلى الأنسجة المتعدد، فإنه لا يزال يتعين تحديد إذا كان هو حقا اللحمة المتوسطة الجمجمة والأنسجة المستهدفة. لدعم الاستنتاج بأن هذا النسيجأمر ضروري لتكون العصيبة، ويبدو غير طبيعي في الجمجمة اللحمة المتوسطة على التحليلات النسيجية في بعض المسوخ الماوس مع اختراج الدماغ 15-17. ومع ذلك، في معظم الحالات، لم يتم تأثير الطفرة على سلوك الخلوية من اللحمة المتوسطة الجمجمة معالجتها.
وقد وضعت لدينا يزدرع فيفو السابقين لدراسة مقايسة مباشرة نتيجة لطفرة جينية أو التلاعب الدوائية على سلوك الخلايا اللحمة المتوسطة الجمجمة 15. هذا الاختبار هي مماثلة لتلك التي نشرتها Tzahor وآخرون 2003 للوصول إلى إمكانية التفريق من اللحمة المتوسطة الجمجمة الذي يكمن وراء rhombomeres 18 سنة ما عدا لدينا تعديل تشريح يزدرع لدراسة خصائص السكان المهاجرة من أكثر من اللحمة المتوسطة الجمجمة الأمامية التي تكمن وراء العصبية الأمامي لوحة. أسلوبنا هو أيضا تعديل المقايسات يزدرع أجريت في الجنين الدجاج لتحليل السلوك المهاجرة من قمة العصبية مع كهالخلافات ذ. وقد explanted الاستعدادات السابقة للقمة العصبية أو الأديم المتوسط مجاور للمحور الخلفي أكثر 19،20. وعلاوة على ذلك، خلال الارتفاع أضعاف العصبية في الجنين الدجاج، قمة العصبية لم هاجر بعد من أنبوب من العصبية الظهرية، وبالتالي اتخذت من إإكسبلنتس الأديم المتوسط مجاور للمحور الأمامي ولن تحتوي على خلايا العصبية قمة. في مقايسة لدينا، يتم إعداد إإكسبلنتس اللحمة المتوسطة الجمجمة التي تتكون من الأديم المتوسط مجاور للمحور، والأديم الظاهر العصبي قمة السطحية ومطلي على ركيزة. لا يمكن أن يؤديها التلاعب التجريبية بما في ذلك عزل إإكسبلنتس من المسوخ الجينية، تصفيح إإكسبلنتس على ECM مختلفة أو العلاجات الدوائية. ويمكن تحليل الخلايا تهاجر من يزدرع والمسافة، عدد والسلوك ومقارنة بين مجموعات العلاج. وبالإضافة إلى ذلك، هذا هو إعداد قابلة للتعديل لتحليل الهجرة الخلوية بواسطة تقنيات التصوير الحية. بعد التجربة الهجرة، يمكن أن تكون ثابتة إإكسبلنتس وتعرض لتحليل المناعى إلى الفراءTHER توضيح تأثير العلاجات. وعلى العموم، وبروتوكول المعروضة هنا هي فيفو السابقين بسيطة الفحص للتحقيق في سلوك اللحمة المتوسطة الجمجمة. كتجربة ممثل، ونحن الاستفادة من هذه مقايسة لدراسة الهجرة من اللحمة المتوسطة الجمجمة على ركائز مختلفة خارج الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تطبيقها هنا يوفر الفحص قوية لدراسة سلوك خلايا اللحمة المتوسطة الجمجمة. ويمكن استخدام بالإضافة إلى تحليلات ثابت المعروضة هنا، ويعيش التجارب في مجال التصوير مشرق أو بالاشتراك مع التعبير عن البروتينات التي تحمل علامات GFP لدراسة السلوكيات من الخلايا في الوقت الحقيقي كما تهاجر من يزدرع. للتجارب التصوير الحي، يمكن أن توصف إإكسبلنتس مع مبادرة ديزرتك الصناعية أو للتمييز هجرة قمة العصبية الأديم المتوسط مجاور للمحور من، ROSA-YFP؛ يمكن أن تستخدم لجنة المساواة العرقية Wnt1 أو خطوط المعدلة وراثيا الأخرى؛ Mesp1-ROSA لجنة المساواة العرقية أو YFP. ويمكن أيضا الجمجمة اللحمة المتوسطة، ECM التفاعلات أن تدرس الاستفادة من هذا الاختبار يزدرع. نحن هنا لوحة إإكسبلنتس على ركائز ECM المختلفة التي موجودة في الجمجمة اللحمة المتوسطة لإظهار أن الخلايا تهاجر على هذه بدرجات مختلفة وأن يؤثر على ECM مورفولوجيا الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ إإكسبلنتس في مصفوفة ثلاثية الأبعاد للوصول إلى سلوكيات سلفي هذا السياق ليرة سورية. هذا الاختبار هو يزدرع قابلة للتعديل لتحليل أثر التلاعب الجيني والدوائي على السلوكيات اللحمة المتوسطة الجمجمة لتحليل الاشارات الجوهرية وخارجي يمكن أن تنظم الهجرة وتعديل. على سبيل المثال، تستخدم في هذا الاختبار نحن دراساتنا أن نستشف دور Hsp90 إفراز فائض في السلوكيات الشاذة الخلوية في اللحمة المتوسطة Hectd1 الجمجمة متحولة 15. في هذه التجارب، وتعامل مع أننا إإكسبلنتس مكافحة Hsp90 الأجسام المضادة، Hsp90 البروتين، وgeldanamycin DMA (amelioride ثنائي ميثيل) لمنع إفراز Hsp90 لإثبات أن سلوك غير طبيعي للخلايا متحولة Hectd1 ومن المقرر أن تتجاوز 15 Hsp90 خارج الخلية. ويمكن استخدام نهج مماثل لتشريح عقاقيري مسارات إضافية الكامنة التشكل طبيعية أو غير طبيعية من اللحمة المتوسطة الجمجمة. بعد الانتهاء من الفحص، يمكن تحليل والخلايا المهاجرة إإكسبلنتس من قبل مجموعة من الأساليب. على سبيل المثال، C التحليلات المناعىأن تستخدم لدراسة وتوطين البروتينات بالغة بالنسبة للتحركات الخلية. ويمكن أيضا أن تستخدم تحليلات Transcriptome لتحديد كيفية العلاج تؤثر التعبير الجيني.
واحد الحد كبير من هذه التقنية هو أنه لا السلوكيات نموذج في أبعاد ثلاثة لأنها يمكن أن تحدث في الجسم الحي. ويمكن استخدام التعديل من حيث هي جزء لا يتجزأ بروتوكول إإكسبلنتس في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (مثل matrigel) جنبا إلى جنب مع التعبير حجرات البروتين بعلامات الفلورسنت الخلوية اللازمة لمعالجة هذه المسألة. حتى لو أجريت هذه التعديلات، وتجارب أخرى لربط السلوكيات ينظر في هذا الاختبار فيفو السابقين مع تلك الموجودة في الجسم الحي يكون ضروريا. وتشمل القيود الأخرى على عدد كبير من الأجنة اللازمة لتوليد عدد كاف لتوليد بيانات هامة بشكل ثابت. الأهم من ذلك، تشريح بسيط نسبيا، فإنه لا تتطلب الممارسة لاتقان.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل HD058629-R01 لIEZ
References
- Copp, A. J. Neurulation in the cranial region–normal and abnormal. Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).
- Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies. The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).
- Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. The genetic basis of mammalian neurulation. Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).
- Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence. J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).
- Tuckett, F., Morriss-Kay, G. Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).
- Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).
- Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro. The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).
- Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds. Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).
- Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme. Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).
- Noden, D. M., Trainor, P. A. Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations. Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).
- Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).
- Morriss-Kay, G., Tuckett, F. Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos. Development. , 106-787 (1989).
- Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation. Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).
- Sarkar, A. A., Zohn, I. E. Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme. The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).
- Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure. Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).
- Chen, Z. F., Behringer, R. R. Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis. Genes Dev. 9, 686-699 (1995).
- Tzahor, E., et al. Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle. Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).
- Lumsden, A. G. Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ. Development. 103, 155-169 (1988).
- Newgreen, D. Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin. Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).
- Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).
