Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Ein. Vorbereitung des ECM Coated Kulturschalen oder Deckgläser Bereiten ECM Stammlösung durch Auflösen ECM Substrat in PBS (Dulbecco Saline, Invitrogen, # 14040-133 Phosphate-Buffered). Filter mit einem 0,2 mm Spritzenfilter (VWR, # 28145-495) und frieren in Aliquots bei -80 ° C. Verdünnen ECM Stammlösung in PBS auf die gewünschte Konzentration. Für MaxGel, in DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11.995-065) verdünnen. Wenn Immunfluoreszenz durchgeführt werden, sterilisieren 12 mm runde Deckgläschen (VWR, # 89015-724) durch Eintauchen in Ethanol und an der Luft trocknen. Dies sollte in der sterilen laminaren Haube erfolgen. Wenn Immunfluoreszenz nicht durchgeführt werden skip to 1,5 fort. Ort sterilisiert Deckgläsern in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen (Corning, # 3526). 0,5 ml des verdünnten Substratlösung zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Absaugen der ECM-Lösung und waschen three-mal in PBS. Absaugen PBS und sofort verwenden oder eingewickelt in Parafilm und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. 2. Vorbereitung der Dissection Werkzeuge Sylgard Platten mit zusätzlichen Aktivkohle pro dem Protokoll des Herstellers vorbereitet. Die widerstandsfähige schwarzem Hintergrund dieser Platten bietet Unterstützung für Pinning sich der Embryo und die Farbe besticht durch guten Kontrast, die Visualisierung des transluzenten Embryos ermöglicht. Um Platten herzustellen wiegen direkt in eine Tri-gießen Becherglas auf einer Waage 150 g Teil A 15 g flüssigen Teil B und 1 g Holzkohle Pulver (World Precision Instruments, # SYLG184). Mischen Sie mit einem Holz popsicle-Stick oder Zungenspatel. Pour in Glas oder Kunststoff 100 cm Gerichten. Verwenden Sie einen kleinen Butanbrenner etwa 10 bis 12 Zentimeter über dem Geschirr zu verbrennen keine Blasen statt. Ort Deckel auf Teller und lassen Sie sich für mindestens 24 Stunden zu setzen. Um Sektionsinstrumenten Einsatz einer Minutien pin vorzubereiten (0,1 mm Durchmer) in einem Stifthalter (Fine Wissenschaftliche Werkzeuge, # und # 26.002-10 26.018-17 jeweils) alternativ 26 Gauge Nadeln (BD, # 309.597) abgekröpften mit Hilfe von Zangen können als Sezieren Instrumente verwendet werden. Geschärften Studenten Dumont Nr. 5 Pinzetten (Fine Science Tools, # 91150-20) mit einem Schleifstein (Fine Scientific Tools, # 29008-22). Sterilisieren alle Sektionsinstrumenten mit 70% Ethanol vor dem Gebrauch. 3. Sammlung von Embryos Euthanize die zeitgesteuerte schwangere Maus auf 8,5 Tage post coitum nach Tiernutzung Ausschuss Vorschriften und entfernen Gebärmutter. Ort Uterus in einer Kunststoff-Petrischale mit sterilem PBS. Waschen Gebärmutter einmal mit sterilem PBS. Unter einem Dissektionsmikroskop vorsichtig Embryo aus Deciduas mit einer Pinzette. Entfernen extraembryonalen Membranen und speichern zur Genotypisierung, wenn nötig. Embryo durch Zählen Somiten. Die idealen Stufen zu machen Explantate auf zellulärer beh analysierenAvior während der neuronalen fache Erhöhung würde zwischen den 6 und 10 Somiten Stadien, wenn die Neuralfalten fangen gerade erst an zu erheben und vor dem großen Morphogenese des kranialen Mesenchym erfolgt sein. Waschen Embryo in PBS. Platz in einem schwarzen Sylgard Platte mit DMEM, die keine Phenolrot (Invitrogen, # 21063-029) enthält. Entfernen Sie die extraembryonalen Membranen und speichern zur Genotypisierung, wenn nötig. 4. Herstellung Explantate Refokussieren des Mikroskops mit der höchstmöglichen Vergrößerung über den Kopfbereich des Embryos. Schneiden Sie mit einem Dissektion Nadel in jeder Hand. Verwenden Sie eine Nadel, um das Gewebe an Ort und Stelle und die anderen halten, um Schnitte zu machen. Schneiden Sie den Kopf des Embryos ventral der Rhombomere. Schneiden Sie entlang der Mittellinie, um den Kopf in zwei gleiche Hälften halbieren. Cut um den äußeren Rand des Kopfes und Mittellinie. Diese Kürzungen werden die premigratory Kamm und Oberfläche Ektoderm am äußeren Rand zu entfernen undDie Prächordalplatte an der Mittellinie. Die restlichen Gewebe wird das Explantat und wird die Migration kranialen Neuralleiste, paraxialen Mesoderm und Oberfläche Ektoderm enthalten. Da das Gewebe geschnitten wird, entfernen Sie seziert Schutt aus der Schale mit einer sterilen Pasteurpipette. Dies verhindert Verwechselns des Explantats mit dem seziert Schutt. Vorsichtig waschen das Explantat durch Pipettieren nach oben und unten mit einem 20 ul Pipettenspitze und Pipetman. Dadurch werden lose anhaftenden Zellen und verhindern gezackten Kanten an den Explantaten. Sorgfältig abholen jedes Explantat in etwa 10 ul der Flüssigkeit mit einem 20 ul Pipettenspitze und Pipetman und Platz in der Mitte des beschichteten Kultur gut. Fügen Sie 20 ul Kulturmedium mit 15% FBS ergänzt das Explantat decken. Die Platte in einer befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) für 1-2 h, damit das Explantat in dem Boden der Schale zu befestigen. Kommen periodisch sicherzustellen, dass das Explantat nicht austrocknetout. Wenn das Explantat angehängt wurde, sorgfältig zu jeder Vertiefung 250 ul DMEM mit 10% FBS ergänzt, die auf 37 ° C im Wasserbad erwärmt wurde hinzuzufügen. Sobald Explantate angeschlossen haben sie sich nicht bewegen, wenn die Platte wird sanft unter dem Mikroskop erschüttert. Zurück Gericht zu Gewebekultur-Inkubator. Nach 24 Stunden werden die Explantate fest angebracht werden und die Zellen beginnen zu emigrieren. Zu diesem Zeitpunkt pharmakologische Mittel können zu den Medien zugegeben werden. 48 Stunden nach dem Ausstreichen, werden Zellen aus den Explantaten gewandert sind. Der Abstand migriert werden können visualisiert werden und abgebildet. Wir in der Regel an die Kultur an dieser Stelle seit Explantate auf Anzeichen einer geringeren Rentabilität mit längeren Inkubationen zeigen beginnen. Ein Vitalfarbstoff wie Acridinorange oder Trypanblau kann auch zur Lebensfähigkeit des Explantats zu überprüfen. An dieser Stelle erworbenen Bilder können, um den Abstand und die Anzahl der Zellen, die aus dem Explantat migrieren dokumentieren. Alternativ wurden, wenn Explantate auf Deckgläsern ausplattiert,sie festlegbar und immunhistochemischen Analysen durchgeführt, um Proteine ​​von Interesse zu visualisieren. Kritischen Schritte in dem Protokoll Geschnitten Explantaten von ungefähr der gleichen Größe. Löschen Sie alle Dissektion Schutt vor der Zerlegung Platte wie Sie sezieren zu verwirrenden Schmutz mit dem gewünschten explantierten Gewebe zu vermeiden sind. Wenn plating Explantate in Brunnen oder auf Deckgläsern sicher sein, Tröpfchengröße von Medien mit Explantat Platz in der Mitte der gut. Lassen Explantation genügend Zeit, um vor Überschwemmungen die gut mit den Medien zu befestigen. Behandlungsbedingungen sollten standardisiert werden für jeden Test Substrat und pharmakologische Mittel verwendet. Zwei Explantate können von jedem Embryo gemacht werden (eine aus der linken und eine von rechts der Neuralrohr). Wenn die Ermittlung der Migration von Zellen aus mutante Mauslinien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, legte eine Mutante Explantat in der Kontrollgruppe und der andere in der behandelten Gruppe. Fehlerbehebung Wenn Explantate zu befestigen scheitern, erhöhen die Redezeit für die Befestigung. Nach unserer Erfahrung haben etwa die Hälfte der Explantate nicht anhängen und größere Explantate effizienter zu halten. Wenn Explantate auf die Peripherie des Bohrlochs legen sie wird schwer zu Bild. Achten Sie darauf, Explantate in der Mitte des Brunnens platzieren. Idealerweise Explantaten wird etwa gleich groß sein. Trotzdem können Abweichungen in Explantat Größe für die Verwendung der Durchmesser der Explantate als Korrekturfaktor bei quanitating Migrationen von Zellen aus Explantaten korrigiert werden. Wenn Kontamination sicher sein, sterile Arbeitsbedingungen benutzt werden. Alle Werkzeuge und Oberflächen sollten mit 70% Ethanol sterilisiert werden. Pipetten und Petrischalen sollten neu und steril. Wenn Explantate immer verloren sind während der Präparation, in regelmäßigen Abständen zu entfernen Schmutz zu verhindern verlieren Explantat. Mastering the Dissektion ist zeitaufwendig und erfordert Übung. Optimal Vergrößerung scharfe Dissektion Werkzeuge und Nadeln Hilfe.