为外植体含量的颅间充质细胞行为评定

1。制备ECM包被的培养皿或盖玻片准备ECM原液中溶解：ECM，衬底在PBS（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，＃14040-133，Invitrogen公司）。使用为0.2mm的注射器过滤器（VWR，＃28145-495）和冻结以等分试样在-80℃下进行筛选 ECM原液稀释在PBS中，以所需的浓度。对于MaxGel，DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基，Invitrogen公司，＃11995-065）中稀释。 如果将进行免疫荧光染色，灭菌通过浸渍在乙醇中的12毫米的圆形玻璃盖玻片（VWR，＃89015-724）和在空气中晾干。这项工作应在无菌层流罩。如果免疫荧光法，将不会执行跳到步骤1.5。 地点灭菌盖玻片在24孔板的各孔中（Corning公司，＃3526）。 0.5毫升稀释的底物溶液加入到24孔板，在室温下孵育3小时温度的各孔中。 吸出的ECM解决方案，并用THRE在PBS的e时代。 吸干PBS及立即使用或包裹在封口膜，并储存于4℃下进行长达2个星期。 2。准备解剖工具 Sylgard的，添加木炭准备每板制造商的协议。这些板的耐药黑色背景提供支持牵制胚胎和颜色提供良好的对比度，便于可视化的透光性的胚胎。 为了准备板，权衡直接进入三倒入烧杯中的平衡150 G部分的液体15克B部分木炭粉和1 g（世界精密仪器，＃SYLG184）。混合在一起，用一个木制的冰棒棍或压舌板。倒入玻璃或塑料100 cm培养皿。用一个小丁烷火炬，举行了约10至12英寸以上的菜烧的气泡。将平板上的盖子，让坐在至少24小时来设置。 准备清扫工具插入一个Minutien针（0.1毫米diameteR）进入的销保持器（精细科学工具，＃26002-10和＃26018-17），分别交替26表针（BD，＃309597），与借助钳子弯曲成直角，可以用作解剖仪器。锋利的学生杜蒙＃5镊子（精细的科学工具，＃91150-20）用磨刀石（精细的科学工具，＃29008-22）。 所有清扫工具，在使用前用70％乙醇消毒。 3。收集胚胎根据使用动物委员会条例安乐死的时间为8.5天coitum孕鼠和取出子宫。 将子宫在塑料培养皿中，用无菌PBS。 用无菌PBS洗净子宫一次。 在解剖显微镜下小心地取出胚胎蜕膜组织，用一个钳子。 删除胚外膜和基因分型，如果需要保存。 计数体节的胚胎阶段。理想的阶段，使外植体，分析细胞BEHavior在神经褶海拔之间的6和10体节阶段时，神经褶才刚刚开始提升的颅间充质细胞的主要形态发生之前。 胚胎在PBS中洗涤。在一个黑色的SYLGARD板用DMEM包含没有酚红（Invitrogen公司，＃21063-029）的地点。删除的胚外膜和基因分型，如果需要保存。 4。外植体的制备再聚焦在头部区域的胚胎在最高可能的放大倍率的显微镜。 用解剖针在每手削减。使用一针保持在地方和其他组织作出削减。 剪去头的菱前的胚胎。 切沿中线平分头，分成两等分。 切的头部和中线周围的外边缘。这些削减将删除的premigratory的的波峰和外边框和表面外胚层的在中线prechordal板。其余的生活将是外植体，将包含迁移颅神经嵴旁轴中胚层和表面外胚层。 当组织被切断，除去解剖的碎片从培养皿用无菌巴斯德吸管。这可以防止混淆了外植体解剖的碎片。 轻轻冲洗外植体，由pipeting向上和向下20微升移液器吸头和PIPETMAN。这将删除松散贴壁细胞和防止外植体边缘呈锯齿状。 小心地拿起每个外植体，在约10微升的液体，使用移液管尖20微升和PIPETMAN和地点的中心处的包被的培养以及。 中加入20μl含15％FBS补充的培养基中，以覆盖外植体。 地点板在湿润的组织培养箱（5％CO 2，37℃）1-2小时，以允许附加到外植体的培养皿的底部。定期查看，以确保外植体不干燥了。 外植体已经附着时，小心地加至每个孔中加入250μl含10％FBS DMEM培养液已被温热至37℃的水浴中。一旦外植体连接时不会移动板在显微镜下轻轻摇动。 返回菜组织培养的孵化器。 24小时后，将外植体牢固地附着和细胞就会开始移民。此时药理剂可添加到介质中。 48小时后，电镀，已经从外植体细胞。可以可视化和成像的距离迁移。我们通常会停止在这一点上，因为文化外植体开始出现较长的孵育的生存能力下降。如吖啶橙或台盼蓝甲活力染色也可用于判断是否将外植体的可行性。 在这一点上，可以获取图像文件从外植体的细胞迁移的距离和数量。另外，如果外植体涂布于盖玻片上，它们可以是固定的，并执行的可视化感兴趣的蛋白质的免疫组织化学分析。 在协议中的关键步骤把外植体的大致相同的大小。 清除所有清扫污物解剖板解剖，以避免混淆所需的移植组织碎片。 当电镀外植体井或盖玻片上是一定要放在液滴的媒体中心以及与外植体。 允许植足够的时间来连接洪水以及与媒体之前，。 每一个测试基板和药理活性剂处理条件应该是标准化的。 两个每个胚胎外植体可以由（一个从左边和从右侧的神经管中的一个）。 当测试迁移的细胞突变小鼠品系不同实验条件下，把一个突变的外植体在对照组和治疗组。 故障排除如果外植体无法连接，增加附件规定的时间。根据我们的经验，约一半的外植体不附加和较大的外植体更有效地附着。 如果外植体附加到井的周围，它们将难以图像。请务必将外植体中心的良好。 理想的情况下，外植体是大致相同的尺寸。然而，外植体大小的差异可以被校正为在quanitating从外植体的细胞的迁移时，使用的外植体的直径作为校正因子。 如果发生污染确保消毒工作条件正在使用。所有的工具和工作表面应用70％乙醇消毒。移液管和培养皿应该是新的和不育。 如果外植体迷路的解剖过程中，要定期清除杂物，以防止丢失的外植体。 掌握解剖非常耗时，而且需要练习。优化正常的放大倍率，锐性剥离的工具和针帮助。