האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

1. הכנת צלחת 1% 24-agarose גם מצופה הוסף 1 גרם agarose (RPI, A20090-500) 100 מ"ל מים deionized בבקבוק 250-500 מ"ל ו החיטוי לעקר agarose (121 ° C, 15 PSI, 15 דקות במכונת החיטוי). להעביר את הבקבוק עם agarose עיקור לתוך אמבט מים C ° 70. Agarose הוא מוכן להיות מזג כשהוא מקורר 70 ° C, שאורך כשעה. הקפד לשמור סטרילי agarose בכל עת. לקבל את 24 גם שטוח התחתונה צלחות (הפלקון, 353047); כל סוג של 24 גם שטוח התחתונה צלחות יעבוד אם את הצלחות ניתן הדמיה במיקרוסקופ שלב לעומת זאת. לוותר על 200 μl של agarose היטב כל אחד עם פיפטה מהדר Eppendorf בארון בטיחות ביולוגית ו מערבולת agarose סביב היטב כדי להפוך אותו לכסות היטב באופן שווה. 200 μl של agarose מתאים ליצירת משטח קעור כך spheroids יכולים ליצור את הצורות כדוריים עקביות. פחות מ 200 agarose μl אסורמכסים היטב לחלוטין, אבל יותר מ 200 agarose μl לא יכול ליצור משטח קעור ואת spheroids גדל על זה לא יכול ליצור צורות כדוריים. את agarose מצופים 24 גם לוחות מוכנים לשמש 10 דקות בערך. (אופציונלי) הוסף 100 μl של המדיום כדי לאזן agarose עם המדיום תרבות לקראת זריעת תאים. לחלופין, לאחר agarose הוא ביסס באופן מלא, להוסיף 100 בינוני צמיחה μl היטב כל לאטום את הצלחות עם הקלטת איטום סטרילית (Nunc, 236366). לוחות אלה ניתן לאחסן 4 ° C עד שבוע אחד. 2. הכנת תרחיפים תא בודד כל הניסויים נעשים תוך שימוש בטכניקות אספטיים סטנדרטיים בארון בטיחות ביולוגית וכל התרבויות מגדלים 37 ° C חממה humidified עם CO 5% 2 באוויר, אלא אם כן צוין. הלבלב האנושי נטו בון-1 התאים נשמרות DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) עם סרום 10% שור עוברית (FBS, Invitrogen,16000-044) בינוני 100 מ"מ x 20 מ"מ צלחת סטרילית בתרביות רקמה (קורנינג, 430167). כאשר monolayer בון-1 התאים מגיעים 70-80% confluency, בינוני מוסר. התאים נשטפים עם PBS פעמיים, וחילצה מן התבשיל על ידי הוספת 1 מ"ל TrypLE (Invitrogen, 12604) עם הדגירה 5 דק 'ב 37 ° C. TrypLE דומה טריפסין אך יציב בגיל 15 – 30 ° C, כמו גם ב 4 ° C. בדוק במיקרוסקופ כדי לוודא שכל התאים מנותקים המנה. הוסף 9 מ"ל צמיחה בינוני לתאי trypsinized ולהשתמש פיפטה כדי פיפטה תאים מעלה ומטה כמה פעמים כדי להבטיח ההשעיה תא בודד אפילו. השתמש 70 מיקרומטר תא מסננת (פישר, 22363548) כדי לסנן את התאים. איסוף תאים ולבצע ספירת תאים באמצעות גויאבה PCA-96 מערכת בסיס (Millipore). הכן את ההשעיה של 5,000 תאים לכל מ"ל ב DMEM/F12 פנול ללא בינוני עם FBS 10% צמיחה. 3. אליפטית תרבות שכבת 200 μl של יחידתא השעיות לצלחת 24-agarose גם מצופה וסוגרים את 24 גם צלחות עם הקלטת איטום סטרילי כדי למנוע אידוי. הערה: – מספר התאים להיות מצופים יש לקבוע באופן אמפירי מבוסס על גודל של spheroids בכל יום 6: 300-400 מיקרומטר קוטר של spheroids יהיו בגודל אידיאלי להתחיל טיפול תרופתי; 1000 בון-1 ו H727 תאים מצופה. – לא מומלץ להתחיל טיפולים תרופתיים אחרי יום 6 כי יכולת הקיום של התאים 3D מתחיל לרדת בסביבות יום 10 (מידע לא מוצג כתב היד בהכנה). מעל מניחים את agarose מצופים 24 גם צלחות עם בון-1 תאים על שייקר מסלולית ב תסיסה איטית מאוד של פחות מ -40 סל"ד לינה 37 ° C חממה humidified עם CO 5% 2 באוויר. ולאחר מכן להעביר את צלחות פלטפורמה יציבה לשמור התרבויות גדל. הוסף 200 μl בינוני צמיחה היטב כל צלחת מעלמכלל כל 3 ימים. לא להפריע את spheroids. נסו להוסיף בינוני דרך הקיר היטב כל על ידי נגיעה בקצה פיפטה לצד הבאר ולתת את זרימת בינוני לתוך הבאר. לפקח על היווצרות אליפטית של 24 צלחות גם תחת מיקרוסקופ. 4. התרופה לטיפול כאשר spheroids מגיעים בסביבות 300-400 מיקרומטר בקוטר ביום 6, spheroids את 3D מטופלים עם תרופות. זה מצוין בתור 0 היום לטיפול תרופתי. ביום 6, כל אחד גם צלחת מכילה כ 400 μl של המדיום. כדי להבטיח את הטיפולים התרופתיים הם בריכוז הסופי 1x ב כל אחד, גם דילולים סדרתי של פי 3 והמנה בכל הטיפולים מתבצעים ממלאי התרופה במדיום 5 מ"ל הצמיחה צינור חרוטי 15 מ"ל, שזה מספיק 8 משכפל. Spheroids שבשורה כל צלחת 24 גם מסווגים ככלי, במינון 1, 2, 3, 4 ו 5. ישנם 4 משכפל עבור כל מנה של טיפולים על הצלחת 24 גם 1 (ראה <strong> לוח 1). בדרך כלל אנחנו מתייחסים spheroids 3D לפחות 2 24 גם צלחות, מה שהופך לפחות 8 משכפל עבור כל מנה של טיפולים. לסובב את הצלחת 24 גם ב 800 סל"ד במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, כדי לוודא שכל condensations בקלטת איטום להיכנס גם כן. בשל תכונה הצף של spheroids 3D, בינוני היטב זה את לא מוסר, כדי למנוע הפרעה spheroids את. בזהירות להוסיף 200 μl של מעל מתוצרת טיפולים של כל מנה לתוך בארות המתאימים לאורך הקיר היטב כל אחד מהם. לסגור את 24 גם צלחות עם הקלטת איטום דגירה התרבויות 37 ° C חממה humidified עם CO 5% 2 באוויר. במידת הצורך, הנסיגה spheroids על כן כל אחד עם המינון המתאים של טיפולים לאחר שעות 72-96. 5. 3d לפקח אליפטית תרבויות בשלב בכל פעם שנבחר לאחר טיפולים תרופתיים (0, 24, 48, 72 שעות), את spheroids בבית של כל אחד לאהוא 24 גם צלחת הם צילמו עם מיקרוסקופ Axiovert Zeiss שלב בניגוד 200/M-based באמצעות המטרה 5x. הערה: דמויות יכולות להילקח על מיקרוסקופ אור עם כל קנה מידה מכוילים בין מיקרומטר ו – פיקסל. המטרה 5x הוא אידיאלי כי spheroids את להגמל במהירות בתחום ההדמיה במטרה 10x. ניתוח אליפטית ניתן לבצע באופן ידני באמצעות Zeiss AxioVision 4.8.2 תוכנה עם תמונות גולמיות. לחלופין, תוכנית מותאמת אישית מפותחת MATLAB משמש לאמוד את גודל spheroids את אוטומטית / חצי אוטומטית. תוכנית אוטומטית מיישמת את האלגוריתם מתאר פעיל 4 במדויק לאתר קווי המתאר של אליפטית בתמונה ניתן למדוד (L) העיקרי ומשניות (W) צירים באופן אוטומטי. גרסה חצי אוטומטית של האלגוריתם זהה מאפשרת למשתמשים לעזור ליזום את התוכנית כאשר חפץ חזק קיים. כל התמונות צריך להיות מיוצא כמו TIFF או JPEG, פורמטים של קבצים מןהתמונות גלם להיקרא על ידי התוכנית. היקף אליפטית נאמדת על 0.5 x אורך x רוחב 2. 6. HistoGel-הטבעה של Spheroids 3D נטו 10-24 spheroids נאספים מתוך 24 גם צלחות, לרחוץ PBS פעמיים, קבוע 10% פורמלין עבור שעה 2, שטף של 50% אתנול ו – 70% במשך 15 דקות פעמיים, בהתאמה, והם מוכנים להטבעת HistoGel. לחלופין, הם יכולים להיות כל הזמן אתנול 70% ב 4 ° C למשך מספר חודשים. צינור קור HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) הוא לשים בכוס מלאה במים. הגביע הוא מחומם במיקרוגל דקות או עד 1 ג 'ל הוא נוזלי לחלוטין, כל הזמן ואז בכוס מלא מים אותו בכל עת. Spheroids את באתנול 70% מלמעלה מועברים cryomold ביופסיה (רקמות Tek, סאקורה Finetek, 4565) באמצעות קיסם. לוודא שכל spheroids מועברים. בואו spheroids יושבים לרגע לשקוע לתחתית של ביוPsy cryomold. נסו להיפטר נוזלים cryomold ביופסיה עם Kimwipes ובינתיים, בעדינות לדחוף את spheroids למרכז בתחתית cryomold ביופסיה באמצעות פלסטיק מתכלה פיפטה פסטר. צעד זה עשוי להיות קל יותר לעשות זאת תחת מיקרוסקופ לנתח. בשכבה דקה של HistoGel המחומם מתווסף cryomold ביופסיה כדי לייצב את spheroids בתחתית cryomold ביופסיה, בינתיים, קיסם משמש כדי לשמור על spheroids במרכז בתחתית cryomold ביופסיה בעדינות רבה. אל תוסיף HistoGel יותר מדי אבל מספיק כדי לייצב את spheroids בתחתית cryomold ביופסיה. תנו את spheroids / HistoGel לשבת 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, או עד HistoGel הוא התגבש. לאחר מכן למלא את שאר cryomold ביופסיה עם HistoGel מחומם. לאפשר לו לגבש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בערך. רק לפני פקיעה את spheroids / לחסום HistoGel מ cryomold ביופסיה, לאהיש את זה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דק ', אשר מסייע קופצים החוצה את spheroids שלמים / לחסום HistoGel. Spheroids את / לחסום HistoGel עטוף אז בפיסת כורכת-Bio (Surgipath, 01090) והכניסו רקמה ו קלטת ביופסיה (פישר סיינטיפיק, 15-182-701D). רקמת ואת קלטת ביופסיה מאוחסן במיכל עם אתנול 70%. אז עיבוד שגרתיות את רקמות נהלים להטבעת פרפין הן בעקבות. 5 בלוק פרפין יכול להיות מחולק לתוך 3-מיקרומטר שקופיות שכבה עבה. השקופיות ניתן מוכתם hematoxylin ו eosin לקבוע שינויים היסטולוגית והוא יכול לשמש גם מכתים immunohistochemical. 7. נציג תוצאות הלבלב האנושי תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווי בון-1 (הניתן על ידי מכון Verto Kjell אוברג, אופסלה, שוודיה), QGP-1 (יפנית למדעי הבריאות קרן, אוסקה, יפן), האדם נוירואנדוקריניים ריאה גידול התא קו H727 (ATCC) היו גדל על agaros כדואר מצופה של 24 גם צלחת. כפי שניתן לראות בתרשים 1, שלוש שורות תאים להראות מורפולוגיה שונה. תאים בון-1 ו H727 נוצר spheroids 3D. מתחת למיקרוסקופ, H727 התאים הראו spheroids הדוק וקומפקטי יותר בון-1 תאים. אנו משערים כי H727 התאים יש יכולת מוגברת של הידבקות תאים תאים ויוצרים צמתים הדוק כתוצאה. QGP-1 תאים להראות גדולים ענבים כמו המוני נקבובי, אשר אינן נחשבות spheroids. בשל העניין הגובר של מחקר הגידול נוירואנדוקריניים הלבלב בשנים האחרונות, בון-1 תאים משמשים שאר הדמויות. לאחר זריעת בון-1 תאים בצלחת 24-agarose גם מצופה, תאיים היווצרות spheroids מתרחש בדרך כלל ביום ה -3 או 4 וה spheroids הופכות עגולות ביום 6 ה. עקב מגבלות תזונה וחמצן, התאים ליבה צפופה של spheroids מתחילים למות סביב 10 יום וביום 17, spheroids מתחילים להתפורר בשל גודל גדול או כךלי מקרים פליטה של ​​הליבה נמקי. Spheroids בדרך כלל יכול לצמוח עד 1,000 מיקרומטר בקוטר. תרשים 2 מציג את הסעיפים של צמיחה היווצרות, והתפוררות של בון-1 spheroids 3D. טיפולים תרופתיים היו התחיל כאשר spheroids היו סביב 300-400 מיקרומטר ותאי שמר על כדאיות גבוהה (כתב היד בהכנה). 6 יום spheroids 3D נבחרו נקודת ההתחלה של טיפולים תרופתיים. זה כבר דווח כי מעכבי היסטון deacetylase הראו השפעות antiproliferative ו proapoptotic על תאים נטו. 6 בחרנו היסטון-deacetylase מעכב Trichostatin-3A (TSA) כדוגמה כדי להמחיש את ההשפעה של טיפולים תרופתיים על spheroids נטו 3D. איור מראה המורפולוגיה של spheroids 3D על גבי טיפול של איור. TSA 3 ב מציג את עוצמת הקול של spheroids 3D על גבי ה-TSA (Sigma, T8552) הטיפול. גודל של אליפטית בנפרד הוערך באופן אוטומטי על ידי cusטום, פיתח תוכנית MATLAB המחשב. 4 צעד ציור ידני נוספה לעזור לרכוש את spheroids, שהיו קרוב לקצה בתמונה נתונה. לפחות 8 spheroids נמדדו לכל מנה של טיפולים TSA בכל נקודת זמן. היקף אליפטית כל 3D חושב כמו אורך x 0.5 x רוחב 2. כפי שניתן לראות באיור 3 א ו 3 ב, יחסית לרכב, את כל מנות של ה-TSA מוצגים הנתונים הראו מידה מסוימת של עיכוב הצמיחה של בון-1 spheroids 3D. ביניהם, הריכוזים של 125 ננומטר ו -250 ננומטר של ה-TSA מאוד לדכא את הצמיחה של spheroids 3D והביאה מוות של תאים בשלב 96 שעות בזמן. כדי להבין היסטולוגיה של spheroids 3D נטו, H & E ו-מכתים immunohistochemical (IHC) בוצעו על spheroids 3D שהיו בתרבית במשך 17 ימים. איור 4 א מדגים שיטה לעיבוד spheroids 3D להטבעת HistoGel, המהווה את המפתח צעד להטבעת פרפין של 3D spher oids. איור 4B מראה מכתים H & E, מכתים immunohistochemical של ביקע caspase-3 (סמן של תאים אפופטוטיים) ו – קי 67 (סמן מתרבים תאים) נוגדנים על spheroids 3D, שהיו בתרבית במשך 17 ימים . התאים בתוך הליבה של spheroids 3D הם נמקים בעיקר / אפופטוטיים והתאים השכבה החיצונית באופן פעיל מתרבים. באיור 1. מורפולוגיה של Spheroids 3D NET. את spheroids 3D של שלוש שורות תאים אנושיים נוירואנדוקריניים סרטניים נוצרים על agarose מצופים 24 גם הצלחות. 1,000 תאים בון-1, H727 ו QGP-1 היו זרועים על agarose מצופים 24 גם הצלחות גדל במצב פיזיולוגי נורמלי כמפורט בפרוטוקול. אלו הן תמונות של spheroids 3D של בון-1 ו H727 או תא אגרגטים עבור QGP-1, אשר היו בתרבית למשך 10 ימים. 18/4218fig2.jpg "alt =" איור 2 "/> איור 2. מעקב גדילה של בון-1 Spheroids 3D מעקב אחר הצמיחה של בון-1 spheroids 3D:., היווצרות גידול והתפוררות של spheroids 3D. כמפורט בפרוטוקול, 1,000 בון-1 תאים מצופה לצלחת 24-agarose גם מצופה. התאים גדלים במצע DMEM/F12 רגיל עם FBS 10% על שייקר מסלולית במצב פיזיולוגי בין לילה, ולאחר מכן עבר על פלטפורמה יציבה גדל באותו מצב. הגידול מעקב אחר התאים 3D באו תאים הדמיה כל שעה למשך שעה 5 1 לאחר ציפוי, ולאחר מכן כל 1-3 ימים עם Axiovert Zeiss 200/M-based שלב לעומת זאת באמצעות מיקרוסקופ המטרה 5x. התאים מצטברים לתוך ההמונים הראשונים, ולאחר מכן ליצור אגרגטים, spheroids תאיים קטנים, spheroids גדולים יותר, ובסופו של דבר spheroids את להתפורר. איור 3. TSA טיפול על בון-1Spheroids 3D. (א ') תמונות של spheroids 3D על גבי הטיפול TSA. הטיפול קבוצה: V – רכב (0.0025% DMSO); D1 במינון 1 (15.625 nM TSA) במינון D2-2 (31.25 nM TSA) D3: מנה 3 (62.5 nM TSA); D4: מנה 4 (125 ננומטר TSA ); D5: מנה 5 (250 ננומטר TSA). זמן הטיפול: 0 H – נקודת זמן כי טיפולים אשר נכתבו ביום 6 spheroids 3D, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו 96 H הן נקודות הזמן לאחר הטיפולים התחיל. Spheroids 3D היו צילמו בכל נקודת זמן כמו קודם. (ב) גידול של spheroids 3D על גבי הטיפול TSA. הגדולות (L) הקטין (W) צירים של spheroids 3D ב (א) נאמדו באופן אוטומטי בכל נקודת זמן של טיפולים (0, 24, 48, 72 ו – 96 שעות) על ידי תוכנית Matlab. נפח של spheroids 3D הוערך 0.5 x אורך x רוחב 2. היקף אליפטית בגרף היה ממוצע של 8 משכפל בר השגיאה חושבה על בסיס 8 משכפל. טבלה 1.פריסה של טיפולים תרופתיים על הצלחת 24 גם איור 4 א. איור של שיטה לעבד Spheroids 3D להטבעת HistoGel. שיטה לעיבוד spheroids 3D להטבעת HistoGel ו מכתים immunohistochemical של spheroids (3D) סקירה של שיטת לעבד spheroids 3D להטבעת HistoGel. Spheroids 3D היו הגלום HistoGel להיות באותה רמה של cryomold ביופסיה, אז HistoGel / בלוק spheroids היה עטוף כחול ביו עוטפת והועברו לתוך קלטת ביופסיה צהוב להטבעת פרפין. איור 4 ב. H & E מכתים והוא מכתים immunohistochemical של יום 17 Spheroids 3D. (ב ') מכתים H & E, מכתים immunohistochemical של Ki-67 ו ביקע caspase-3 של 17 יום spheroids 3D. עמ 'araffin-משובצים שקופיות היו מחולקות למדורים deparaffinized ואחזור אנטיגן בוצעה באמצעות CCI (מיזוג תאים פתרון, Verana הרפואי המערכת, # 711-065-152). הארנב polyclonal קי-67 נוגדנים (Abcam. # Ab833) ו ביקע caspase 3 נוגדנים (התא איתות טכנולוגיה, # 9661) יושמו בריכוז של 1:75 ו – 1:200, בהתאמה, עבור שעות 1 בטמפרטורת החדר. נוגדנים נגד ארנב משני (ג'קסון Immunolab, # 711-065-152) יושמה על 1:500 עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר, ואחריו chromogenic איתור ערכת DABMap (Ventana מערכות רפואיות, # 760-124). שקופיות היו counterstained עם Hematoxylin ו מיובש פינה לפני coverslipping מ קסילן.