Fluoreszierend<em> In situ</em> Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Ein. Chromosome Vorbereitung Mückenlarven aufgezogen wurden mit einem Standard-Protokoll in Methods in Anopheles Forschung zur Verfügung beschrieben auf der Website der Malaria Forschung und Reference Reagent Resource Center (MR4) 13. Die Temperaturen von Moskito Aufzucht wurden geändert, um die höchste Anzahl von Chromosomen in Imaginalscheiben und niedrigsten Mortalität der Larven liefern. Die Stufen der Mückenlarven Entwicklung wurden auf der Grundlage der Größe ihres Kopfes Kapseln 13 bestimmt. Hatch Mücke Eier bei 28 ° C, und nach 2-3 Tagen, Transfer 2 nd oder 3 rd Larven bis 16 ° C für Ae. aegypti und Cx. quinquefasciatus und auf 22 ° C für eine. gambiae. Platz 4 th Larven auf Eis für einige Minuten zur Immobilisierung. Übertragen Larve zu einer Folie mit einem Tropfen kalten hypotonen Lösung (0,5%, sodium Citrat oder 0,075 M Kaliumchlorid) und platzieren Sie sie unter dem Stereomikroskop. Wählen Larve mit ovalen IDs (Abbildung 1B) zur weiteren Präparation. Enthaupten Larve, und schneiden Sie die Nagelhaut von der Bauchseite des larvalen Thorax mit Präparierscheren (Abbildung 2A). Nehmen Sie zusätzliche Schnitt im zweiten oder dritten Abdominalsegment, um den Darm von der Larve zu sezieren. Die Richtungen der Schnitte sind durch Pfeile dargestellt. Öffnen Sie die Nagelhaut, und entfernen Sie den Darm und fetten Körper von der Larve. Entfernen Sie die hypotone Lösung aus der Folie mit Filterpapier, und fügen Sie einen frischen Tropfen hypotonen Lösung direkt auf die IDs (Abbildung 2B). Halten Larve in hypotonischer Lösung für 10 min bei RT. Entfernen hypotone Lösung mit Filterpapier und gelten Carnoy-Lösung (Ethanol / Essigsäure in Verhältnis 3:1). Nach der Zugabe von Fixierlösung, IDS sofort wieder weiß und werden leicht unter dem Mikroskop sichtbar (Abbildung 2C </strong>). Mit Präpariernadeln, entfernen IDs von der Larve (Abbildung 2D), und übertragen Sie sie zu einem Rückgang von 50% Propionsäure. Eventuelle andere Gewebe, wie dem Darm und Fettkörper, von der Folie. Titelbild IDs mit einem unsiliconized 22×22 Deckglas, und halten Sie für 10 min bei RT. Bedecken Sie den Objektträger mit Filterpapier und Squash das Gewebe, indem Sie den Radiergummi eines Bleistifts auf dem Umfang des Deckglases. Kurz analysieren die Qualität der Folie mit dem Phasenkontrast-Mikroskop mit 100x oder 200x Vergrößerung (Abbildung 3). Zubereitungen mit> 50 Chromosomen Spreads können als geeignet für FISH werden. Tauchen Sie und halten Sie die Folie in flüssigem Stickstoff bis er Blasen stoppt. Entfernen des Deckglases von dem Schieber mit einer Rasierklinge, und übertragen die Folie sofort in einen Behälter mit 70% Ethanol bei -20 ° C gekühlt Lagerung bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde für die beste Dehydration Ergebnis (wenn nötig, können Dias t gespeichert werdenseinen Schritt von einigen Minuten bis zu mehreren Tagen). Dehydratisieren Dias in einer Reihe von Ethanol (70%, 80%, 100%) bei 4 ° C für jeweils 5 min, und bei RT trocknen. Trocken lagern Objektträger bei -20 ° C vor Verwendung sie für FISH. 2. Extraktion von Repetitive DNA Fraktionen Durchführen FISH des BAC-Klons DNA-Sonde auf Chromosomen von Ae. aegypti und Cx. quinquefasciatus erfordert mit unmarkierten repetitiven DNA Fraktionen auf unspezifische Hybridisierung der DNA-Wiederholungen in den Chromosomen blockieren. Die Reassoziation von Einzelstrang-DNA in Stücke von mehreren hundert bp fragmentiert folgt eine C 0 t Kurve wobei C 0 die Anfangskonzentration der Einzelstrang-DNA und t die Zeit Reannealing. Fraktionen mit DNA C0t Werte gleich 10 -4 -10 -1 oder 10 ° -10 2 als hoch und mäßig wiederholende, jeweils betrachtet. Auszug 400-500 ug des genomischen DNA aus dem gesamten erwachsenen Mücken mit Qiagen Blood and Cell Culture Maxikit und bereiten 100-1000 ng / ul DNA-Lösung in 1,2 x SSC. DNA denaturiert, indem ein sicheres-Schleusenrohr mit genomischer DNA in einen Heizblock vorgewärmt auf 120 ° C für 2 min. Hohe Temperatur hilft, DNA in 200-500 bp Fragmente reichen. In Abhängigkeit von der DNA-Konzentration, reassoziieren DNA, indem das Röhrchen bei 60 ° C für 15-150 min bis C 0 t DNA Fraktionen zu erhalten bis C 0 t3 (Tabelle 1). Das Röhrchen mit DNA auf Eis für 2 min. Übertragung der DNA auf 42 ° C, Hinzufügen vorgewärmten 10x S1 Nuklease-Puffer und S1 Nuklease in einer Endkonzentration von 100 U pro 1 mg DNA und für 1 Stunde inkubiert. Präzipitat-DNA durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat und 1 Volumen Isopropanol bei RT. Zentrifugieren bei 14.000 UpM für 20 min bei 4 ° C. Waschen DNA in 70% Ethanol und zentrifugieren bei 14.000 UpM für 10 minbei 4 ° C. Luft trocknen und lösen DNA-Pellet in TE-Puffer. Messung der DNA-Konzentration und Visualisieren durch Gelelektrophorese. Normalerweise ist die Anzahl der repetitiven DNA Fraktionen repräsentiert 35-50% der ursprünglichen DNA-Menge. 3. DNA Probe Labeling Zwei verschiedene Protokolle wurden für die Kennzeichnung BAC-Klon DNA-Sonde und IGS rDNA Sonde verwendet. 3,1 BAC-Klon Kennzeichnung mit Nick-Translation Auszug BAC-Klon-DNA aus dem BAC-Bibliothek mit Qiagen Large Construct Kit. Planen Reaktionsmischung zur Nick-Translation Kennzeichnung auf Eis mit Endvolumen von 50 ul: 1 ug DNA isoliert BAC-Klon, 0.05 mM jeweils von unmarkiertem dATP, dCTP und dGTP und 0,015 mM dTTP, 1 ul Cy3-dUTP (oder ein anderes Fluorochrom), 0,05 mg / ml BSA, 5 ul 10x Nick-Translations-Puffer, 20 U DNA-Polymerase I und 0,0012 U DNase. Inkubieren bei 15 ° C für 20,5 Std. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 1 ul 0,5 M EDTA. Shop-Sonde bei -20 ° C an einem dunklen Ort. 3,2 IGS rDNA Kennzeichnung mittels PCR Planen Reaktionsgemisch auf Eis mit Endvolumen von 50 ul: 200 ng genomische DNA, 0,05 mM jeweils von unmarkiertem dATP, dCTP und dGTP, 0,015 mM dTTP, 1 ul Cy3-dUTP (oder einem anderen Fluorochrom), 5 ul 10x PCR-Puffer, 50 pmol von vorn; UN (GTGTGCCCCTTCCTCGATGT) und umgekehrt; GA (CTGGTTTGGTCGGCACGTTT) Primer zur Amplifikation IGS, und 10 U Taq DNA-Polymerase 14. PCR-Reaktion durchzuführen mittels Standard-PCR-Parameter für IGS Amplifikation: 95 ° C / 5 min x 1 Zyklus; (95 ° C / 30 sec, 50 ° C / 30 sec, 72 ° C / 30 sec) x 30 Zyklen; 72 ° C / 5 min x 1 Zyklus; und 4 ° C zu halten 14. Shop-Sonde bei -20 ° C an einem dunklen Ort. 4. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung <em> Diese FISH Protokoll umfasst zwei Varianten: die erste für die Verwendung BAC-Klon DNA als Sonde auf mitotische Chromosomen Ae. aegypti und Cx. quinquefasciatus und die zweite für die Verwendung IGS rDNA auf mitotische Chromosomen An. gambiae. Bei der Verwendung von BAC-Klon DNA-Sonden, die Schritte überspringen RNase-Behandlung 4,3, 4,4 und parallele Folienpräsentation / Sonde Denaturierungsschritt 4,19. Bei Verwendung IGS rDNA-Sonde, bereiten Hybridisierung Mischung ohne C 0 t DNA Fraktionen, und überspringen separate Folie / Sonde Denaturierung Schritte 4,10, 4,11, 4,16 und 4,17. Die Objektträger in 2x SSC für 30 Minuten bei 37 ° C. Entwässern Folien in Serie von 70%, 80% und 100% Ethanol für jeweils 5 min bei RT und an der Luft trocknen. Bei Durchführung FISH mit BAC-Klon DNA, gehen Sie direkt auf 4,5 fort. Inkubieren Chromosom Zubereitung in 0,1 mg / ml RNase Lösung unter Parafilm für 30 min bei 37 ° C. Zweimal waschen in 2x SSC für jeweils 5 min bei 37 ° C. Legen Sie Dias ina jar mit 0,01% Pepsin und 0,037% HCl-Lösung und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Waschen Folien in 1x PBS für 5 min bei RT. Fix Chromosom Zubereitung in ein Gefäß mit 1% Formalin in PBS 1x von 10% hergestellt neutral gepuffertem Formalin für 10 min bei RT. Waschen Folien in 1x PBS für 5 min bei RT. Entwässern Folien in Serie von 70%, 80% und 100% Ethanol für jeweils 5 min bei RT und an der Luft trocknen Präparate bei 37 ° C. Bei Durchführung FISH mit IGS, gehen Sie direkt zu 4,12 Schritt Denaturieren Dias in einem Glas mit vorgewärmtem 70% Formamid für 2 min bei 72 ° C. Entwässern Folien Reihe von Kälte (-20 ° C) 70%, 80% und 100% Ethanol für jeweils 5 Minuten, und an der Luft trocknen bei 37 ° C. Bereiten Hybridisierungsmischung:. 5 ul markierten Sonde DNA aus Schritt 3, 10 ul C 0 t DNA aus Schritt 2 mit einer Endkonzentration von 0,5 ng / ul und 5 ul 1 ug / ul beschallte Lachssperma-DNA für Fische mit IGS rDNA, bereitenHybridisierung Mischung ohne C 0 t DNA Fraktionen. Präzipitat-DNA durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol. Halten Sie bei -20 ° C für 1-3 Stunden. Zentrifuge bei 14.000 rpm bei 4 ° C für 20 min, das Ethanol, und an der Luft trocknen das Pellet bei RT. Gründlich das Pellet in 10 ul Hybridisierungspuffer:. 50% Formamid, 20% Dextransulfat, 2x SSC Wenn Durchführung FISH mit IGS, gehen Sie direkt zu 4,18 Schritt Denaturieren Hybridisierungsgemisch für 7 min bei 97 ° C, und sofort auf Eis gestellt für 1 min. Prehybridize Mischung bei 37 ° C für 30 min bis unspezifische Hybridisierung der repetitiven DNA in den Chromosomen verhindern. Zeigen 10 ul der Hybridisierung Mischung auf der Folie, und Abdeckung mit einem 22×22 Deckglas. Verhindern Blasenbildung – Luftblasen sollten mit leichtem Druck auf das Deckglas entfernt werden, wenn die Durchführung FISH mit BAC-Klon DNA, gehen Sie direkt zu 4,20 Schritt <./ Em> Denaturieren der Sonde und chromosomalen DNA simultan mittels Heizblock bei 75 ° C für 5 min. Kleber Deckglas um den Umfang mit Gummi-Zement. Führen Hybridisierung über Nacht in einer feuchten Kammer bei 37 ° C. Entfernen Gummilösung und Deckglas vom Objektträger. Waschen Schlitten 2 min in vorgewärmten Lösung 1 (0,4 x SSC, 0,3% Nonidet-P40) bei 73 ° C. Waschen Folien in Lösung 2 (2x SSC, 0.1% Nonidet-P40) für 5 min bei RT. Gegenfärbung Folie mit 0,001 mM YOYO-1 in 1x PBS für 10 min in der feuchten Kammer bei RT. Montieren in einer kleinen Menge an Gold-Prolong antifade Reagens mit einem Deckglas. Analysieren Präparate unter einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filter-Sets bei 1.000-facher Vergrößerung (Abbildung 4). 5. Repräsentative Ergebnisse Insekten-IDs werden in jedem Segment der Larve befindet. Je nach Stellung, they in verschiedene Gewebe verwandeln im erwachsenen Stadium des Insekts. Die IDs, die für die Herstellung Chromosom in diesem Protokoll verwendet werden, in Beine beim erwachsenen Stadium der Mücke entwickeln. Diese IDs sind an der ventralen Seite des Thorax Larvenstadium befindet und deutlich sichtbar sind durch die Kutikula unter dem Mikroskop (Abbildung 1). Am frühen 4. Larvenstadium Larvenstadium haben IDs eine runde Form (Abbildung 1A). Die größte Anzahl der Mitose werden ~ 175 in ein ID 9, zu einem späteren "ovale" Bühne (Abbildung 1B), die als die optimale Bühne für Präparat muss angesammelt. Zu diesem Zeitpunkt teilt das Zwischenstück in zwei ID: eine Transformationen in einen Schenkel und eine andere verwandelt sich in einen Flügel. Wir bevorzugen mit den großen Bein-IDs auf dem "ovalen" Bühne für das Chromosom Präparat. 1C stellt IDs auf dem neuesten Stand der 4 th instar Larve Entwicklung. In diesem Stadium, dasIDs sind bereits in Beinen und Flügeln entwickelt, und enthalten eine signifikante Menge von differenzierten Gewebe und eine niedrige Anzahl von Mitose. Dieses Stadium der ID Entwicklung sollte für das Chromosom Präparat vermieden werden. Wir empfehlen auch die Aufzucht Mückenlarven bei niedrigen Temperaturen:. 16 ° C für Aedes und Culex und 22 ° C für Anopheles Dies hilft, die Menge der Mitose in IDs 9 erhöhen. Abbildung 2 zeigt ID Dissektion aus dem Thorax von 4 th instar Larve. Da die Kutikula einer Live-Insekt ist schwer zu sezieren, empfehlen wir die Verwendung Präparierscheren statt der Nadeln häufig für Larven der Herstellung verwendet. Das wichtigste Verfahren zur Gewinnung von hochwertigen Chromosom Vorbereitung ist die hypotonische Lösung Behandlung. Für beste Ergebnisse, entfernen wir den Darm und fetten Körper aus dem Larvenstadium Thorax vor dieser Behandlung. Schwellung der ID-Zellen während dieser Prozedur hilft Chromosom verteilts auf einem Schlitten (3A). Die geeignete Qualität der hypotonischen Lösung Behandlung kann leicht durch die runde Form der Zellen in den Zubereitungen (3A, B) erkannt werden. Zellen mit einer ovalen Form zeigen eine unzureichende Behandlung hypotonischen Lösung (3C). Um FISH gewählt werden, Chromosomen Vorbereitung mindestens 50 hochwertige Chromosom Spreads. Normalerweise haben ~ 90% der Folien hergestellt unter Verwendung dieses Protokolls ausreichende Qualität für FISH 9. Wir präsentieren zwei leicht unterschiedliche FISH-Protokolle: ein erweitertes Protokoll für FISH unter Verwendung genomischer BAC-Klon DNA-Sonde auf mitotischen Chromosomen Aedes und Culex und einer einfachen FISH-Protokoll für IGS rDNA Sonde auf mitotischen Chromosomen Anopheles. Die Genome von Aedes und Culex sind stark repetitiven wegen der Überrepräsentation von Transposons 7,8. So Durchführung Fische, die utilizes genomischen BAC-Klon-DNA als Sonde, erfordert das Hinzufügen unmarkierten repetitiven DNA Fraktionen an die Sonde, um unspezifische Hybridisierung der DNA-Wiederholungen auf Chromosomen blockieren. Für die Extraktion der repetitiven DNA Fraktionen wird genomische DNA bei 120 ° C für 2 Minuten denaturiert. Siedenden DNA bei einer hohen Temperatur hilft auch DNA in Fragmente von 200-500 bp zu erhalten. DNA läßt man nach dieser Behandlung reassoziieren. Die stark repetitiven DNA-Fragmente neigen dazu, ihre Kumpel für Reassoziation schneller als DNA mit einzigartigen Sequenzen nicht zu finden. Als ein Ergebnis folgt die Reassoziation von DNA einen C 0 x t-Kurve, wobei C 0 die Anfangskonzentration der Einzelstrang-DNA, und t die Zeit Reannealing. DNA Fraktionen mit C 0 t Werte gleich 10-4 – 10-1 oder 100-102 sind hoch und moderat repetitive, als jeweils. Der Zeitpunkt der Neuzuordnungs für verschiedene C 0 t DNA Fraktionen können berechnet werden unter Verwendung the Formel t = C 0 t X × 4,98 / C 0, wobei t – Zeit der Inkubation, C 0 t X – C 0 t Fraktion (C0t 1 = 1, C 0 t 2 = 2, etc.) und C 0 – Ausgangs-DNA-Konzentration in ug / ul 15 (Tabelle 1). Nach Reassoziation wird die Einzelstrang-DNA verdaut mit S1 Nuklease. Wir bevorzugen Verwendung aller C 0 t DNA Fraktionen bis zu C 0 t 3 zusammen anstelle des üblicherweise verwendeten C 0 t 1 DNA-Fraktion. Diese C 0 t Fraktionen gehören einige der moderat repetitiven DNA-Sequenzen und zusammen Regel stellen 35-50% der ursprünglichen Menge der genomischen DNA in Ae. aegypti. Die richtige Verhältnis zwischen markierte DNA-Sonde und unmarkierten C 0 t DNA-Fraktion hängt von der repetitiven DNA-Komponente in jedem einzelnen BAC-Klon. Im Durchschnitt verwenden wir 01.20 Sonde C 0 tDNA-Fraktion Anteil für eine akzeptable Signale / Hintergrund-Verhältnis der FISH Ergebnis. Vorhybridisierung der DNA-Sonde mit C 0 t DNA Fraktionen in einem Röhrchen 30 min vor der eigentlichen Hybridisierung auf der Folie trägt auch zur Hintergrund zu reduzieren. Etikettierung Hybridisierung selbst und das Waschen in diesem Protokoll durchgeführt unter Verwendung von Standardbedingungen 12. Die FISH Ergebnisse von zwei unterschiedlich markierten BAC-Klon DNA-Sonden auf mitotische Chromosomen Ae. aegypti und Cx. quinquefasciatus sind in 4A und B gezeigt. Die BAC-Klon-DNA-Sonden zu erzeugen starke Signale in einer einzigen Position auf den Chromosomen. Chromosomen in 1 gezeigt sind mit YOYO-1 Iodid gegengefärbt. Dieser Farbstoff produziert die besten Bandenmuster auf Ae. aegypti Chromosomen 9. Alternativ können andere fluoreszierende Farbstoffe wie DAPI oder Propidiumjodid, für th genutzt werdene-Chromosom Gegenfärbung. Zur Unterdrückung Ausbleichen der Folien verwenden wir verlängern Gold-antifade Eindeckmedium. Dieses Reagenz hat eine gute Konservierung Signal Fähigkeiten und kann auch leicht von der Folie werden durch Spülen in 1 × PBS, wenn es notwendig, die für mehrere gleiche Schlitten Hybridisierungen verwenden ist entfernt. Eine einfache Version des FISH-Protokoll ist für die Hybridisierung von IGS rDNA Sonde auf mitotischen Chromosomen Anopheles konzipiert. Ribosomalen Gene in Anopheles als einer polymorphen Cluster von Genen auf Geschlechtschromosomen 16 befindet vertreten. Eine DNA-Sonde in diesem Protokoll markiert ist mittels Standard-PCR Reaktion durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten Cy3 oder Cy5 dNTPs. Weil Blockieren unspezifischer Hybridisierung der repetitiven DNA in Euchromatin nicht benötigt wird, werden alle Schritte in Bezug auf den C 0 t DNA Fraktionen weggelassen. Stattdessen werden Chromosom Präparate mit RNase zur Verhinderung der Hybridisierung der IGS rDNA Sonde vorbehandeltdie Nukleolus. Chromosomen und die DNA-Sonde gleichzeitig durch Erwärmen der Folie zusammen mit einer Sonde in einer Hybridisierung System bei 75 ° C für 5 min denaturiert. Hybridisierung und Waschen in diesem Protokoll sind auch unter Verwendung von Standard-Bedingungen für FISH 12. Das Ergebnis der FISH ist in 4C gezeigt: der Polymorphismus des IGS rDNA Hybridisierung zwischen zwei X-Chromosomen ist deutlich sichtbar. DNA-Konzentration ug / ul Reannealing, min C 0 t 2 0,1 100 0,3 33 0,5 20 0,7 14 0,9 11 1 10 <tdrowspan > C 0 t 3 0,1 150 0,3 50 0,5 30 0,7 21 0,9 17 1 15 Tabelle 1. DNA-Konzentration und Reannealing Zeiten für die Herstellung von C 0 t2 und C 0 t3 Fraktionen. Abbildung 1 Stufen des ID Entwicklung in 4 th instar Larve: A) eine frühe "runde" Bühne; B) ein Zwischenprodukt "oval" stage – optimal für das Chromosom Vorbereitung; C) ein spätes Stadium – ungeeignet für Chromosom Vorbereitungen. . Die Positionen der IDs sind durch Pfeile auf der ventralen Seite des Thorax larvalen angedeutet. Abbildung 2 Schritte der ID Dissektion: A) enthaupteten Larve (die Richtung der Schnitte sind durch Pfeile angedeutet), B) Larven mit seziert gut unter hypotonen Lösung Behandlung (IDs anschwellen und fast unsichtbar); C) Larve nach Carnoys Lösung (. IDs werden weiß und deutlich sichtbar); D) IDs in Carnoy-Lösung präpariert. Positionen der IDs in Larven sind durch Sternchen gekennzeichnet. Abbildung 3 unterschiedliche Qualitäten des Chromosoms Spreads: A) eine perfekte Chromosom Spread – runde Form der Zellen zeigt ausreichende Behandlung der IDs in hypotonen Lösung; B) eine perfekte hypotone Behandlung – Chromosomen sind etwas undersquashed; C) eine schlechte Chromosom Verbreitung. – das Ergebnis derunzureichende hypotonische Behandlung wird durch ovale Form der Zellen angegeben. Abbildung 4. Beispiele für FISH mit BAC-Klone (A, B) und IGS rDNA (C) in den Chromosomen Ae. aegypti (A), Cx. quinquefasciatus (B) und ein. gambiae (C). 1, 2 und 3 – Zahlen von Chromosomen, X – weiblichen Geschlechts-Chromosom in eine. gambiae.