Análise de célula específico<em> Arabidopsis</em> Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

1. Geração de protoplastos Material de colheita e corte de folha em 1 mm de largura (Figura 1) com uma lâmina de barbear. Para amostras que contêm mais do que uma única folha de até 15 folhas podem ser facilmente empilhadas antes de cortar. Transferir imediatamente tiras de folha em uma placa de Petri 9 centímetros redondo contendo 20 ml de solução A (400 mM de manitol, 20 mM de hidrato de MES, 20 mM de KCl, 10 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2, 0,1% de BSA e 2,5 mM β-mercaptoetanol, pH 5,7) incluindo as enzimas protoplasting (1,2% de celulose de R-10, 0,6% de celulose e 0,4% de RS macerozyme R-10) e RNase e inibidores da transcrição (1 × ProtectRNA e 10 ug / ml de actinomicina D); suavemente separar as tiras de folha e vácuo para se infiltrar 2 × 5 min. Prato Petri lugar em um agitador orbital ajustado para 90 rpm à temperatura ambiente e de protoplastos por 3-4 horas. Durante a incubação, as tiras de folhas devem ser separadas umas das outras, através da utilização de umconjunto de pinças planas, em intervalos de meia hora. Coloque um 70 um coador de células (Fisher Scientific) num tubo de 50 ml e cuidadosamente filtrar a solução através de protoplasting. Isto irá remover as tiras de folha, que serão retidos pelo crivo, permitindo que os protoplastos de passar. Lave as tiras de folha com 4 ml de solução A e suavemente filtro através do mesmo crivo. Transfira os protoplastos em tubos de fundo redondo e centrifugar a solução de protoplastos a 300 xg durante 5 min para sedimentar os protoplastos. Aspirar cuidadosamente fora tanto do sobrenadante quanto possível, sem perturbar os protoplastos. Lave os protoplastos com 5 ml de solução A e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante Ressuspender os protoplastos em um volume apropriado de solução A, usando uma pipeta de Pasteur ou um P1000 ponta de corte. 2. FACS de protoplastos de folha </p> Imediatamente antes da classificação, ressuspender os protoplastos usando uma (não corte) P1000 dica para evitar aglomeração protoplastos juntos. Transferir para um tubo de protoplastos de triagem por meio de um filtro de 50 um filcon (BD Biosciences) e dilui-se, conforme adequado, para evitar o entupimento do bocal do classificador de células. Os protoplastos são classificados usando um bico de 100 ^ M a uma pressão de 20 psi (invólucro) e 21-21,5 psi (amostra), de uma frequência de 39,2 kHz e uma taxa de eventos de <4000 (essas configurações são óptimas em um separador de células influx bd (bd biosciences) otimização. nas máquinas triagem outros celulares podem precisar ajustes para essas configurações). protoplastos gfp positivas identificadas usando laser árgon 488 nm e traçando a saída do 580 30 passa-banda filtro (cor laranja) relaçãoao 530 40 (verde). estará no alto low população, com não-protoplastos baixo > Figura 2. As linhas KC464, KC274 e TP382 utilizados neste estudo. A) seção transversal de uma folha mostrando KC464 expressão GFP na epiderme adaxial. B) derivado de protoplastos KC464 folhas. C) a secção transversal de uma folha de KC274 mostrando a expressão da GFP na vasculatura. D) Os protoplastos derivados de KC274 folhas. E) TP382 folha que mostra a expressão da GFP em células guarda. F) derivado de protoplastos TP382 folhas. G) Exemplo do enriquecimento obtido por FACS de células que expressam GFP de guarda no fundo complexo de células da folha, mostrando GFP contendo protoplastos a partir da elevada população 530/low 580 de protoplastos derivados de TP382 folhas. AF: imagens de microscópio confocal; G: imagem do microscópio de fluorescência. Barras de escala dentro das imagens são de 50 m. Figura 3. Típicos FACS parcelas de aquisição de pontos de saída dos 580/30 nm (laranja) vs 530/40 nm (verde) filtros de banda (BD Influx seleccionador de células). Os portões de classificação apresentados são os normalmente usados ​​durante a classificação. A) Ponto de trama Col-4 protoplastos derivados de folhas, protoplasted na ausência de inibidores, que mostram uma única população baixa 530/low 580. B) a partir de wt trama Dot Cl-4 protoplastos derivados de folhas, protoplasted na presença de inibidores, indicando uma mudança na fluorescência 580 devido ao stress e coloração pelos inibidores. CE) Dot parcelas de folha protoplastos derivados a partir das linhas KC74, KC464 e TP382, respectivamente, protoplasted na presença de inibidores, mostrando a GFP contendo populações no alto 530/low 580 populações. As porcentagens dos eventos nos (alta 530/low 580) GFP populações são dadas. Clique aqui para ver maior figura . "fo: manter-together.within-page =" e_content sempre "> Figura 4. Expressão da GFP nas fracções representativas de populações fechadas, como mostrado na Figura 3. Duas réplicas biológicas foram obtidos para cada tipo de fracção, amplificado utilizando o Sistema Ovation Pico WTA e qPCR GFP utilizando-se os iniciadores específicos (Tabela 2) foi então realizada. Os valores apresentados são os mais elevados (vermelho), o mais baixo (verde) e média de valores relativos. A população foi elevada 580, neste caso, dividido em dois, baixo 530/low 580 e 530/low alto 580, para o qual apenas uma repetição, biológica foi utilizada para que apenas o valor único é apresentado. ACT2 (At3g18780) foi utilizado como um padrão para todas as amostras. Folha: folha inteira. Unsorted: protoplastos não separados. GFP1: 530/low alto 580 e Rest1: 530/low baixo 580, GFP2: 530/high alto 580 e repouso2: 530/high baixo 580, tal como descrito na Figura 3 e da inserção. Os resultados são a verificação of avaliações ópticas da GFP conteúdo celular nas frações classificadas (2G por exemplo, a figura). Clique aqui para ver maior figura . Amostra No. de folhas No. de células RNA rendimento (Ng) RNA rendimento (Amplificado; ng) A folha inteira B folha inteira 1 1 – – 8001 10525 4623 *** 4572 *** Protoplastos Unsorted A B protoplastos Unsorted 5 5 – – 2433 2625 1152 *** 3321 *** A GFP1 A Rest1 15 6039 (0,39% *) 55389 (6.40% *) – ** – ** 861 489 GFP1 B Rest1 B 15 10.783 (0,63% *) 57040 (7,49% *) – ** – ** 537 420 GFP2 Repouso2 15 18.337 (1,49% *) 62.405 (73,49% *) – ** – ** 360 411 Exemplos Tabela 1. Obtidos utilizando FACS e analisadas com qPCR para determinar que fracção continha vivas que expressam GFP-protoplastos. Também estão incluídos nesta tabela é o rendimento em ng de RNA total, antes e depois de amplificação com o Ovation Pico WTA System (NuGen). GFP1 fracções, GFP2, Rest1 e repouso2 são como mostrado na inserção da Figura 4. * A percentagem de células do tipo de célula total de funcionamento é dado entre parêntesis ao lado do número de células na fracção. Esses percentuais não são correlacionadosoutro para cada amostra como o tipo FACS corre para frações "descanso" foram interrompidos mais cedo do que para frações GFP devido ao número muito maior de células de descanso coletados. ** 50 ng usado como entrada para as reacções de amplificação, como por protocolo do fabricante. Cartilha Seqüência mGFP5-ER.fw GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA mGFP5-ER.rv TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT ACT2.fw GCCATCCAAGCTGTTCTCTC ACT2.rv GCCATCCAAGCTGTTCTCTC Primers Tabela 2. QPCR.