Analyse cellulaire spécifique de<em> Arabidopsis</em> Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé
Summary
Procédé de fabrication d'<em> Arabidopsis</em> Protoplastes de feuilles qui sont compatibles avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), ce qui permet l'étude des populations cellulaires spécifiques. Cette méthode est compatible avec n'importe quel<em> Arabidopsis</em> Line qui exprime la GFP dans un sous-ensemble de cellules.
Abstract
Après le début de l'ébauche de feuille, l'accumulation de la biomasse est commandé principalement par la prolifération des cellules et de l'expansion dans les feuilles 1. Toutefois, la feuille d'Arabidopsis est un organe complexe composé de plusieurs types cellulaires différents et plusieurs structures. Dans le même temps, la feuille de plus en plus contient des cellules à différents stades de développement, les cellules les plus éloignées du pétiole Soyez le premier à arrêter l'expansion et se soumettre à la sénescence 1. Les différentes cellules dans la feuille sont donc diviser, élongation ou de différenciation; actif, stressés ou morts, et / ou répondre à des stimuli dans les sous-ensembles de leur type cellulaire à un moment donné. Cela rend l'étude génomique de la contestation feuille: par exemple lors de l'analyse des données d'expression de feuilles entières, des signaux de réseaux génétiques qui opèrent dans des zones distinctes de réponse cellulaire ou des types cellulaires seront confondus, résultant en un profil inexactes généré.
Pour résoudre ce problème, slusieurs méthodes ont été décrites qui permettent les études d'expression génique de cellules spécifiques. Il s'agit notamment de capture microdissection laser (LCM) 2 ou les plantes exprimant la GFP utilisées pour la production de protoplastes et après le tri cellulaire par fluorescence (FACS) 3,4, le système a récemment décrit l'état intact de précipitation nucléaire 5 et 6 immunoprécipitation de polysomes.
FACS a été utilisé avec succès pour un certain nombre d'études, notamment en montrant que l'identité de la cellule et la distance de l'extrémité de la racine a eu un effet significatif sur les profils d'expression d'un grand nombre de gènes 3,7. FACS de lignes GFP ont également été utilisées pour démontrer spécifique des cellules régulation transcriptionnelle lors des interventions d'azote racines et le développement des racines latérales 8, 9 Répartition sel de stress auxine dans la racine 10 et de créer une carte d'expression génique du méristème apical Arabidopsis 11. Bien queFACS a déjà été utilisée pour trier les protoplastes de feuilles d'Arabidopsis dérivés fondés sur autofluorescence 12,13, jusqu'à l'utilisation de FACS sur des lignes d'Arabidopsis exprimant la GFP dans les feuilles a été très limitée 4. Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode pour obtenir des protoplastes de feuilles d'Arabidopsis qui sont compatibles avec FACS, tout en minimisant l'impact du régime de production de protoplastes. Nous démontrons la méthode utilisant la ligne KC464 Arabidopsis, qui expriment la GFP dans l'épiderme ventral 14, la ligne KC274, qui expriment la GFP dans le tissu vasculaire 14 et la ligne Arabidopsis TP382, qui expriment la GFP construction en double lié à un signal de localisation nucléaire les cellules de garde (données non présentées, figure 2). Nous sommes en train d'utiliser cette méthode pour étudier à la fois l'expression spécifique au type cellulaire au cours du développement et le stress, ainsi que des populations de cellules hétérogènes à différents stades de la sénescence.
Protocol
Discussion
Nous avons décrit une méthode qui permet l'utilisation de plantes d'Arabidopsis exprimant la GFP dans les feuilles pour la production de protoplastes et tri cellulaire ultérieure à l'aide FACS. Cette méthode donne des quantités suffisantes d'ARN à être utilisées pour l'amplification et l'analyse subséquente par conséquent supporte qPCR ou puce à ADN. Les fractions triées sont hautement enrichi pour la GFP contenant des cellules, tel que démontré par qPCR (Figure 2).
Pour obtenir des rendements élevés de protoplastes vivants, il est essentiel de travailler rapidement au cours des premières étapes de la procédure, jusqu'à ce que les bandes de feuilles ont été infiltrées sous vide avec la solution de protoplastes contenant l'inhibiteur. En outre, lors de la génération bandes de 1 mm feuilles, il est très important de trancher ou couper les feuilles plutôt que «chop» ou écrasez-les, car cela conduit à des dommages excessifs et donc un rendement inférieur de protoplastes.
Une différence cruciale entre la méthode décrite ici et publishe autreméthodes d est l'utilisation d'inhibiteurs de RNase et d'inhibiteurs de la transcription. La plupart des méthodes sont développées pour les racines d'Arabidopsis, dont protoplastes peuvent être générées plus facilement. Toutefois, lorsque vous travaillez avec des feuilles, à l'exception du mésophylle, il est nécessaire d'augmenter le temps de génération de protoplastes. Par conséquent, il est important d'inclure ces inhibiteurs pour protéger contre les variations de l'expression des gènes à la suite du traitement génération de protoplastes lui-même (données non présentées). Cependant, la présence des inhibiteurs conduit à une incapacité à monter une réponse transcription, soit par commutation des gènes ON ou OFF, ce qui est susceptible de rendre les protoplastes plus vulnérables car cela conduit à une perte de plasticité permet de contrer le stress de la protoplastes procédure.
Nous avons utilisé la méthode décrite ici avec succès un certain nombre de lignes exprimant la GFP Arabidopsis. Surtout, nous avons utilisé cette méthode avec des lignes GFP exprimant la GFP soit fortementle noyau, ou beaucoup plus faiblement de manière non-localized/diffuse cytosolique, comme c'est le cas avec les KC464 KC274 et lignes utilisées ici. Les deux types de lignes sont compatibles avec la méthode et le rendement des fractions hautement enrichi de GFP exprimant protoplastes (Figure 2 et 3). La méthode pourrait être facilement adaptée à d'autres fluorophores, bien que le fluorophore doit être sélectionné pour que la fluorescence est significativement différente de l'autofluorescence des cellules mortes / meurt afin de préserver la possibilité de sélectionner les cellules vivantes.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travailler dans le laboratoire Buchanan-Wollaston sur le profilage stade des cellules de type et de développement spécifique est prise en charge par le projet AGRON-OMICS (subvention n LSHG-CT-2006-037704) dans le cadre Progamme 6 ème de la Commission européenne. Travailler dans le laboratoire Gifford sur un type de cellule spécifique profilage est soutenu par une subvention de nouveau chercheur BBSRC (BB/H019502/1).
Les KC274 KC464 et les lignes d'Arabidopsis ont été obtenus à partir de l'AAR Webb (Université de Cambridge).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
| Cellulase RS | Melford | C8003 |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
References
- Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review. Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).
- Kleber, R., Kehr, J. Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection. Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).
- Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. A Gene Expression Map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925 (2010).
- Beal, R. B., Henikoff, S. A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue. Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. PNAS. 106, 18843-18848 (2009).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map. Science. 318, 801-806 (2007).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. PNAS. 105, 803-808 (2008).
- Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science. 320, 942-945 (2008).
- Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
- Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche. PNAS. 106, 4941-4946 (2009).
- Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts. PNAS. 87, 816-820 (1990).
- Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it’s potential as a research tool. Plant Methods. 4, 6 (2008).
- Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -. M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression. J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).
