Cel specifieke analyse van<em> Arabidopsis</em> Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering
Summary
Werkwijze voor het produceren<em> Arabidopsis</em> Bladprotoplasten die compatibel zijn met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), waardoor studies van specifieke celpopulaties. Deze werkwijze is compatibel met elk<em> Arabidopsis</em> Lijn die GFP uitdrukt in een subset van cellen.
Abstract
Na starten van het blad primordium wordt biomassa accumulatie voornamelijk bepaald door celproliferatie en uitbreiding in de bladeren 1. De Arabidopsis leaf is een complex orgaan bestaat uit vele verschillende celtypes en verschillende structuren. Tegelijkertijd de groeiende bladeren bevat cellen in verschillende stadia van ontwikkeling, met de cellen die het verst van de steel als eerste te stoppen uitbreiding ondergaan senescentie 1. Verschillende cellen in het blad Daarom verdelen, verlengen of differentiatie, actieve, gestrest of dood, en / of reageren op stimuli in sub-sets van de cellulaire type tegelijk. Hierdoor genomisch onderzoek van het blad uitdagende, bijvoorbeeld bij het analyseren van expressie gegevens van hele bladeren, signalen van genetische netwerken die in verschillende cellulaire respons zones of celtypen worden verward, wat resulteert in een onjuiste profiel wordt gegenereerd.
Om dit aan te pakken, eneveral werkwijzen beschreven waarmee studies van cel genexpressie. Deze omvatten laser-capture microdissectie (LCM) 2 of GFP tot expressie brengende planten voor protoplast en volgende fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) 3,4, de recent beschreven INTACT voor nucleaire neerslag 5 en immunoprecipitatie van polysomen 6.
FACS is met succes gebruikt voor een aantal studies, waaronder waaruit blijkt dat de celidentiteit en afstand van de wortelpunt een significant effect op de expressie profielen van een groot aantal genen 3,7 had. FACS van GFP lijnen zijn ook gebruikt om cel-specifieke transcriptionele regulatie in wortel stikstof reacties en laterale wortelvorming 8, 9 zoutstress auxine verdeling in de wortel 10 tonen en een genexpressie kaart van de Arabidopsis shoot apicale meristeem 11 maken. HoewelFACS is eerder gebruikt om Arabidopsis leaf verkregen protoplasten gebaseerd op autofluorescentie 12,13 sorteren, tot dusver het gebruik van FACS op Arabidopsis lijnen GFP tot expressie brengen in de bladeren zeer beperkt 4. In het volgende protocol beschrijven we een werkwijze voor het verkrijgen Arabidopsis bladprotoplasten die compatibel zijn met FACS terwijl het minimaliseren van het effect van de protoplast generatie regime. We tonen de werkwijze volgens de KC464 Arabidopsis lijn, die uitdrukkelijk GFP in de epidermis adaxiale 14, KC274 lijn, die uitdrukkelijk GFP in het vaatweefsel 14 en TP382 Arabidopsis lijn, die een dubbele GFP expressie construct gekoppeld aan een nucleair lokalisatiesignaal in de sluitcellen (data niet getoond, figuur 2). Momenteel gebruiken deze methode zowel celtype specifieke expressie tijdens de ontwikkeling en stress, alsook heterogene celpopulaties bestuderen in verschillende stadia van senescentie.
Protocol
Discussion
We hebben een werkwijze beschreven dat het gebruik van Arabidopsis planten die GFP in de bladeren protoplast en volgende celsortering met FACS maakt. Deze methode levert voldoende hoeveelheden RNA te gebruiken voor amplificatie en daardoor daaropvolgende analyse door een qPCR of microarray. De fracties worden gesorteerd sterk verrijkt GFP-bevattende cellen, zoals aangetoond door qPCR (Figuur 2).
Om een hoge opbrengst van levende protoplasten is het essentieel snel werken tijdens de eerste stappen van de procedure, totdat het blad strips zijn vacuüm geïnfiltreerd met de inhibitor bevattende protoplast oplossing. Bovendien, bij het genereren van 1 mm blad strips is het zeer belangrijk te snijden of knippen de bladeren dan "hakken" of mash, omdat dat leidt tot overmatige slijtage en dus een lagere opbrengst protoplast.
Een essentieel verschil tussen de hier beschreven methode en published methoden is het gebruik van RNase remmers en transcriptie remmers. De meeste methoden ontwikkeld voor Arabidopsis stammen waaruit protoplasten kunnen gemakkelijker worden gegenereerd. Echter werkt met bladeren, behalve mesofyl, moet de protoplast generatietijd verhogen. Daarom is het belangrijk om deze remmers omvatten om tegen veranderingen in genexpressie bescherming als gevolg van de protoplast generatie behandeling zelf (gegevens niet getoond). De aanwezigheid van de remmers leidt tot een onvermogen om een transcriptie reactie te ontwikkelen, hetzij door het inschakelen of uitschakelen van genen, die waarschijnlijk om de protoplasten kwetsbaarder omdat dit leidt tot een verlies van plasticiteit waarmee tegen de spanningen van de protoplasting procedure.
We hebben de hier beschreven werkwijze met succes met een aantal GFP tot expressie Arabidopsis lijnen. Belangrijk is, hebben we gebruik gemaakt van deze methode met GFP lijnen GFP tot expressie brengen, hetzij sterk inde kern, of veel zwakker in een cytosolisch non-localized/diffuse wijze, zoals het geval is met de KC464 en KC274 lijnen hier gebruikt. Beide soorten lijnen zijn geschikt voor de methode geven hoogverrijkt fracties van GFP-expressie protoplasten (figuur 2 en 3). De werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan andere fluoroforen, hoewel de fluorofoor worden gekozen voor fluorescentie die significant verschilt van de autofluorescentie van dode / stervende cellen om het vermogen om levende cellen te selecteren behouden.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk in de Buchanan-Wollaston lab op cel-type en het ontwikkelingsstadium tot specifieke profilering wordt ondersteund door de AGRON-OMICS project (subsidie # LSHG-CT-2006 tot 037.704) in de 6 e Kaderprogramma progamma van de Europese Commissie. Werk in de Gifford lab op cel-type specifieke profilering wordt ondersteund door een BBSRC New Investigator Grant (BB/H019502/1).
De KC274 en KC464 Arabidopsis lijnen werden verkregen van AAR Webb (Universiteit van Cambridge).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
| Cellulase RS | Melford | C8003 |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
References
- Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review. Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).
- Kleber, R., Kehr, J. Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection. Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).
- Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. A Gene Expression Map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925 (2010).
- Beal, R. B., Henikoff, S. A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue. Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. PNAS. 106, 18843-18848 (2009).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map. Science. 318, 801-806 (2007).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. PNAS. 105, 803-808 (2008).
- Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science. 320, 942-945 (2008).
- Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
- Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche. PNAS. 106, 4941-4946 (2009).
- Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts. PNAS. 87, 816-820 (1990).
- Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it’s potential as a research tool. Plant Methods. 4, 6 (2008).
- Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -. M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression. J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).
