تحليل خلية معينة من<em> ل arabidopsis</em> يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز
Summary
وهناك طريقة لإنتاج<em> ل arabidopsis</em> أوراق protoplasts التي تتوافق مع مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)، مما يسمح للدراسات السكان خلية معينة. هذا الأسلوب هو متوافق مع أي<em> ل arabidopsis</em> الخط الذي يعبر عن GFP في مجموعة فرعية من الخلايا.
Abstract
بعد الشروع في منشم ورقة، يتم التحكم تراكم الكتلة الحيوية بشكل رئيسي من قبل تكاثر الخلايا والتوسع في الأوراق 1. ومع ذلك، فإن ورقة ل arabidopsis هو جهاز معقد يتكون من العديد من أنواع مختلفة من الخلايا والهياكل عدة. في الوقت نفسه، ورقة تحتوي على خلايا النمو في مراحل مختلفة من التنمية، مع خلايا أبعد من كونها أول سويقات لوقف توسيع والخضوع الشيخوخة 1. خلايا مختلفة داخل ورقة يتم تقسيم لذلك، أو التمطيط تمييز؛ بالموقع، وشدد أو ميتا، و / أو الاستجابة للمحفزات في مجموعات فرعية من نوعها الخلوية في أي وقت من الأوقات. هذا يجعل الدراسة الجينومية تحديا للأوراق: على سبيل المثال عند تحليل البيانات من أوراق التعبير كلها، إشارات من شبكات الوراثية العاملة في مناطق متميزة استجابة الخلوية أو أنواع الخلايا سوف يكون مرتبك، مما أدى إلى الملف غير دقيقة التي يتم توليدها.
لمعالجة ذلك، قوقد وصفت وسائل everal الدراسات التي تمكن من التعبير الخلية الجينات المحددة. وتشمل هذه الليزر التقاط تسليخ مجهري (LCM) 2 أو النباتات GFP التعبير المستخدم لتوليد البروتوبلازم واللاحقة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 3،4، ونظام وصف مؤخرا INTACT لهطول الأمطار النووية 5 و مناعي من polysomes 6.
وقد استخدمت بنجاح لFACS عدد من الدراسات، بما في ذلك تبين أن هوية الخلية والمسافة من قمة الجذر كان لها تأثير كبير على ملامح التعبير من عدد كبير من الجينات 3،7. كما تم FACS GFP من خطوط الخلايا المستخدمة لإثبات محددة خلال تنظيم النسخي الردود النيتروجين الجذر الوحشي والتنمية الجذرية 8، 9 توزيع الملح الإجهاد أوكسين في جذر 10 و لإنشاء خريطة التعبير الجيني من النسيج الإنشائي القمي ل arabidopsis تبادل لاطلاق النار 11. رغم أنوقد سبق FACS تستخدم لفرز أوراق protoplasts ل arabidopsis المستمدة يعتمد على تألق ذاتي 12،13، وقد تم حتى الآن استخدام FACS على خطوط التعبير عن GFP ل arabidopsis في أوراق محدودة جدا 4. في البروتوكول وصفنا التالية طريقة للحصول على ورقة protoplasts ل arabidopsis التي تتوافق مع FACS مع التقليل من تأثير البروتوبلازم نظام الجيل. نحن لشرح طريقة استخدام خط ل arabidopsis KC464، التي ترتبط صريح بناء GFP في البشرة متجه نحو المحور 14، السطر KC274، التي تعبر عن GFP في الأنسجة الوعائية (14) والخط ل arabidopsis TP382، والتي تعبر عن ضعف GFP إلى إشارة توطين النووية في الخلايا حارس (البيانات لا تظهر؛ الشكل 2). نحن نستخدم هذه الطريقة في الوقت الحالي لدراسة كل خلية من نوع التعبير محددة خلال تطوير والإجهاد، فضلا عن السكان غير متجانسة الخلايا في مراحل مختلفة من الشيخوخة.
Protocol
Discussion
وقد وصفت لنا طريقة التي تسمح للاستخدام النباتات معربا عن GFP ل arabidopsis في الأوراق لتوليد البروتوبلازم واللاحقة الفرز الخلية باستخدام FACS. هذه الطريقة تعطي كميات كافية من الحمض النووي الريبي لاستخدامها لتضخيم والتحليل اللاحق لذلك من قبل أي من qPCR أو ميكروأري. والتخصيب في الكسور لفرز الخلايا التي تحتوي على GFP، كما يتبين من qPCR (الشكل 2).
لتحقيق عوائد عالية من protoplasts الحية من الأهمية بمكان العمل بسرعة خلال الخطوات الأولية لهذا الإجراء، حتى شرائط ورقة تم الفراغ تسلل مع الحل البروتوبلازم التي تحتوي على مثبط. وبالإضافة إلى ذلك، عند إنشاء شرائح 1 مم ورقة من المهم جدا لشريحة أو قطع الأوراق بدلا من 'فرم' أو الهريس لهم، وهذا يؤدي إلى الضرر المفرط وبالتالي تحقيق عائد أقل البروتوبلازم.
ووصف الفرق الحاسم بين طريقة أخرى هنا والمنشورهد طرق هو استخدام مثبطات مثبطات ريبونوكلياز والنسخي. يتم تطوير معظم الطرق لجذور arabidopsis، والتي يمكن أن تتولد protoplasts بسهولة أكبر. ومع ذلك، عند العمل مع أوراق، باستثناء نسيج الورقة المتوسط، من الضروري زيادة الوقت الجيل البروتوبلازم. ولذلك من المهم أن تشمل هذه مثبطات للحماية من التغيرات في التعبير الجيني نتيجة للمعاملة نفسها الجيل البروتوبلازم (المعطيات غير معروضة). ومع ذلك، فإن وجود مثبطات يؤدي إلى عدم القدرة على إيجاد رد فعل النسخ، إما عن طريق التحول الجينات أو إيقاف تشغيلها، والتي من المرجح أن تجعل protoplasts أكثر عرضة لأن هذا يؤدي إلى فقدان اللدونة التي لمواجهة الضغوط من protoplasting الداخلي.
وقد استخدمنا الطريقة الموضحة هنا بنجاح مع عدد من خطوط، معربا عن GFP ل arabidopsis. الأهم من ذلك، وقد استخدمنا هذا الأسلوب مع خطوط التعبير عن GFP GFP إما بقوة فيالنواة، أو أكثر من ذلك بكثير ضعيفة بطريقة عصاري خلوي non-localized/diffuse، كما هو الحال مع خطوط KC464 KC274 وتستخدم هنا. كلا النوعين من خطوط متوافقة مع أسلوب وتسفر الكسور عالي التخصيب من GFP، معربا عن protoplasts (الشكل 2 و 3). يمكن أن يكون وسيلة تكيف بسهولة مع fluorophores الأخرى، على الرغم من يجب تحديد fluorophore لمضان التي تختلف كثيرا عن تألق ذاتي من الخلايا الميتة / الموت من أجل الحفاظ على القدرة على تحديد الخلايا الحية.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم عمل في المختبر، ولاستون بوكانان على التنميط المرحلة خلية من نوع والتنموية المحددة من قبل المشروع أغرون-OMICS (منحة # LSHG-CT-2006-037704) في إطار أولى برنامج ال 6 من المفوضية الأوروبية. ويدعم عمل في المختبر على خلايا جيفورد من نوع التنميط محددة من منحة BBSRC محقق جديد (BB/H019502/1).
تم الحصول على خطوط KC274 KC464 ول arabidopsis من AAR ويب (جامعة كامبردج).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
| Cellulase RS | Melford | C8003 |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
References
- Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review. Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).
- Kleber, R., Kehr, J. Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection. Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).
- Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. A Gene Expression Map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925 (2010).
- Beal, R. B., Henikoff, S. A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue. Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. PNAS. 106, 18843-18848 (2009).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map. Science. 318, 801-806 (2007).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. PNAS. 105, 803-808 (2008).
- Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science. 320, 942-945 (2008).
- Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
- Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche. PNAS. 106, 4941-4946 (2009).
- Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts. PNAS. 87, 816-820 (1990).
- Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it’s potential as a research tool. Plant Methods. 4, 6 (2008).
- Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -. M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression. J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).
