Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine

Isolamento degli acidi nucleici: isolati acidi nucleici sono PCR amplificabile ed esenti da contaminazione proteine. Esempio 1: Gli acidi nucleici recuperati sono adatti per l'uso in applicazioni basate su PCR. Ad esempio, la Figura 2 mostra l'amplificazione di geni di tossina Shiga associati enteroemorragica E. coli O157: H7 ceppo EDL-933 (ATCC # 35150) da un acido nucleico / proteina procedimento di estrazione con la pipetta di estrazione. I geni della tossina Shiga STX stx 1 e 2 sono disponibili sul temperato lambda-like batteriofago e difettoso batteriofago in questo e altri enteroemorragica E. coli sotto il controllo del promotore P R 5 6 7 8. L'attivazione della risposta SOS in E. coli porta a profago induzione e / o produzione di tossina 9. Abbiamo utilizzato una versione modificata del saggio PCR multiplato da Feng et al. 11 per identificare l'stx 1 e STX 2 geni in cultura e campioni delle acque reflue a spillo. Corsie A e B nella figura 2 mostrano i risultati di una amplificazione PCR di un campione di coltura non trasformato (corsia A) e un campione cultura elaborato (corsia B). Questi risultati sono praticamente identici significato vi è alcuna perdita di fedeltà negli acidi nucleici isolati o trasformati. Abbiamo poi amplificato a spillo acque reflue non trattate (corsia D) o isolati gli acidi nucleici da liquami a spillo corsie (E & F). Questi dati indicano che gli acidi nucleici isolati comportato maggiore rispetto amplificazione degli acidi nucleici non-isolato da campioni spiked liquami. Abbiamo quindi concludere che sia inibitori della PCR naturalmente presenti nelle acque di scarico sono stati rimossi dopo isolamento o che gli acidi nucleici sono stati concentrati su di isolamento. Una combinazione di queste due ipotesi è anche possibile. Spettroscopia ultravioletta è stato accanto usato per dimostrare che gli acidi nucleici isolati erano relativamente liberi of proteina contaminante. Figura 3 mostra gli spettri UV di due E. coli O157: H7 estrazioni acido nucleico, isolamento con A e B isolamento, rispetto allo spettro normalizzato della coltura batterica, etichettato pre-isolamento. Gli spettri UV degli acidi nucleici isolati assomiglia spettri di pure acidi nucleici, avente un rapporto calcolato di assorbanza tra 260 nm e 280 nm avvicinano 1,8 10. Questi dati mostrano che vi è molto poco proteine ​​contaminanti nella frazione di acido nucleico recuperato usando la tecnica descritta. Isolamento delle proteine: proteine ​​recuperato dal acidi nucleici / proteine ​​esperimento di isolamento è immunoreattiva e elettroforeticamente identica alla proteina pura. Esempio 2: La frazione di proteina isolata è stata applicata alla E. RapidChek coli O157 strisce laterali di flusso saggio (SDIX, Inc.). I controlli mostrano una identificazione positiva in tutti i campioni ospitano E. coli O157, con o senza induzione STX (figura 4, corsie B e C, rispettivamente). I dati in figura 4 mostrano anche risultati positivi per i campioni ospitano E. coli O157 che sono stati elaborati per acidi nucleici e proteine ​​poi con la pipetta di estrazione. Questi dati dimostrano che la proteina isolata da ogni campione è immunoreattiva innescando così una risposta positiva. Amplificazione PCR (come descritto nell'Esempio 1) è stata effettuata sui campioni di proteine ​​per dimostrare che la frazione di proteina isolata era privo di contaminanti acidi nucleici. I risultati di questi esperimenti erano tutti negativi mediante elettroforesi su gel. Quindi, concludiamo che il contenuto proteico del campione è stata separata dalla contaminazione acidi nucleici. Questi risultati, preso in complesso con quelli descritti per la fase di isolamento nucleico mostra acido che gli acidi nucleici e proteine ​​contenuti sono isolati in fasi distinte di frazionamento. t "> Esempio 3:. La proteina isolata è adatto per elettroforesi 10 La Figura 5 illustra un coomassie macchiata gel di acrilammide 8% caricato con BSA (Figura 5, corsie A e C) e BSA isolato da 6M guanidina isotiocianato utilizzando l'estrazione pipetta e associato protocollo. La mobilità elettroforetica della proteina isolata è identica a quella dei campioni di controllo. Abbiamo quindi concludere che il processo di estrazione non altera la struttura covalente della proteina isolata. Figura 1, Panel A: Rappresentazione di una tipica procedura di estrazione degli acidi nucleici Il campione viene mescolato con 6M guanidina tiocianato nella provetta campione e passato sopra l'assorbente cinque volte.. Dopo l'ultimo passaggio, il campione viene aggiunto al tampone di estrazione delle proteine. Gli acidi nucleici adsorbimento e legato vengono lavate due volte con etanolo. Il campione è poi libero in aria dRied e eluite dalla sorbente. Figura 1, pannello B: Rappresentazione di un tipico procedimento di estrazione delle proteine ​​Il campione miscelato con tampone isolamento delle proteine ​​dal passaggio 1, Figura 1, pannello A è passato sopra la sorbente di una pipetta seconda estrazione 15 volte.. Il resto della procedura è identico a quello del protocollo di estrazione degli acidi nucleici. Figura 2:. Immagine negativa di un macchiato etidio bromuro di gel di agarosio Un multiplex gene della tossina Shiga 1 e 2 esperimento di amplificazione è stata eseguita utilizzando campioni di cultura (corsie A e B) o dei campioni di liquami non trattati addizionati con E. coli O157: H7 (corsie D, E e F). I campioni sono stati aggiunti direttamente a un tubo di reazione di PCR (corsie A e D), oppure i campioni sono stati elaborati usando il proces isolamentos e gli acidi nucleici estratti sono stati aggiunti al tubo di reazione di PCR (campioni B, E e F). Il protocollo PCR è una modifica di quella descritta da Feng et al 11. La nostra modifica mirata solo quelli amplificata dalla stx 1 (fascia inferiore) e stx 2 (fascia superiore) coppie di primer, abbandono tutte le altre coppie di primer. Corsia C è la scala da BioRad 1Kb. Figura 3: risultati della spettroscopia UV E. coli O157: H7 acidi nucleici isolato con la pipetta di estrazione riportato isolati Gli acidi nucleici sono etichettati isolamento a e b isolamento.. Lo spettro UV del campione è stato anche testato prima dell'estrazione dell'acido nucleico ed è etichettato pre-isolamento. Gli spettri sono stati ottenuti utilizzando uno spettrofotometro Hitachi U3010 e pacchetto software associato. <br/>. Figura 4: Foto a colori di strisce reattive RapidChek Il contenuto proteico dei campioni utilizzati in figura 2 è stato isolato con la pipetta di estrazione e testati per immuno-reattività con test a flusso laterale. Lanes AC sono i controlli non trasformati, che è, è stato aggiunto coltura cellulare per la striscia di test senza estrazione di acidi nucleici o di proteine. Corsia A è E. coli BL21 DE3 pLysS come controllo negativo, corsie B e C mostrano E. coli O157: H7 che era non trattata (B), o trattate con mitomicina C per 4 ore (C). Lanes D attraverso H mostrano i risultati di aggiunta della proteina estratta per le strisce di prova di flusso laterali. Lanes D ed E sono stati sondati utilizzando estratti proteici da E. coli BL21 DE3 pLysS o senza (D) o trattamento con mitomicina C (E) come controlli negativi. Lanes FH mostrano i risultati quando le proteine ​​estratte da E. coli O157: H7 è stato utilizzato. La proteina è stata estratta da non trattata (F), o da 2 ore (G) o 4 ore (H) mitomicina C colture trattate.Risultati positivi producono una doppia linea rossa. Figura 5:. Fotografia di uno colorato con Coomassie SDS-PAGE BSA è stato isolato dalla soluzione mediante la pipetta estrazione e protocolli descritti. Corsie A e C sono corsie di controllo di 250 ug / ml e 500 pg / ml, rispettivamente. Corsie B e D rappresentano BSA recuperato da soluzioni contenenti le stesse concentrazioni rispettivi controlli.