Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Nukleinsäure-Isolierung: Isolierte Nukleinsäuren sind PCR-amplifizierbare und frei von Protein Verunreinigungen. Beispiel 1: Die gewonnenen Nukleinsäuren sind für die Verwendung in PCR-basierte Anwendungen. Zum Beispiel zeigt 2 die Verstärkung des Shiga-Toxin-Gene mit enterohämorrhagischen E. zugeordnet coli O157: H7-Stamm EDL-933 (ATCC # 35.150) von einer Nukleinsäure / Protein-Extraktionsverfahren unter Verwendung der Extraktion Pipette. Die Shiga-Toxin-Gene stx 1 und stx 2 sind auf gemäßigten Bakteriophagen Lambda-like und defekten Bakteriophagen in diesem und anderen enterohämorrhagische E. gefunden coli-Stämme unter der Kontrolle des P R Promotors 5 6 7 8. Die Aktivierung des SOS-Reaktion in E. coli führt zur Induktion und / oder Toxinproduktion 9 Prophagen. Wir haben eine modifizierte Version des Multiplex-PCR-Assay von Feng et al genutzt werden. 11 zur Identifizierung des stx 1 und stx 2 Gene sowohl in Kultur und Spike Abwasserproben. Die Spuren A und B in 2 zeigen die Ergebnisse einer PCR-Amplifikation eines unverarbeiteten Kulturprobe (Spur A) und einer verarbeiteten Kulturprobe (Spur B). Diese Ergebnisse sind praktisch identisch Sinn gibt es keinen Verlust der Treue in der verarbeiteten oder isolierten Nukleinsäuren. Wir nächste Stachelwalze Rohabwasser (Spur D) oder isolierten Nukleinsäuren aus dotierten Abwasser (Spuren E & F) verstärkt. Diese Daten zeigen, dass die isolierten Nucleinsäuren in größere Verstärkung im Vergleich zu den nicht isolierten Nukleinsäuren aus dotierten Abwasserproben geführt. Wir schließen daraus, dass entweder PCR-Inhibitoren natürlich im Abwasser nach der Isolierung vor der Aufhebung oder dass die Nukleinsäuren wurden nach der Isolierung eingeengt. Eine Kombination dieser beiden Hypothesen ist ebenfalls möglich. UV-Spektroskopie wurde als nächstes verwendet werden, um zu zeigen, dass die isolierten Nukleinsäuren relativ frei waren of Mengen an Protein. Abbildung 3 zeigt die UV-Spektren von zwei E. coli O157: H7-Nukleinsäure-Extraktionen markierten Isolierung ein und Isolierung b, im Vergleich zu der normalisierten Spektrums der Bakterienkultur, markierten prä-Isolation. Die UV-Spektren der isolierten Nukleinsäuren ähnelt der Spektren reiner Nukleinsäuren, mit einem berechneten Verhältnis der Extinktion zwischen 260 nm und 280 nm 1.8 10 nähert. Diese Daten zeigen, dass es eine sehr kleine Mengen an Protein in der Nukleinsäure-Fraktion gewonnen unter Verwendung der Technik beschrieben. Proteinisolierung: gewonnene Protein aus der Nukleinsäure / Protein Isolationsexperiment immunreaktiv ist und elektrophoretisch identisch reines Protein. Beispiel 2: Das isolierte Protein-Fraktion wurde in der RapidChek E. angewendet coli O157 Lateral-Flow-Assay-Streifen (SDIX, Inc.). Kontrollen zeigen eine positive Identifikation in allen Proben beherbergt, E. coli O157, mit oder ohne STX Induktion (Abbildung 4, Spuren B bzw. C). Die Daten in Abbildung 4 zeigen auch positive Ergebnisse für die Proben, beherbergen E. coli O157, die für Nukleinsäuren und Proteine ​​dann mit der Pipette Extraktion verarbeitet wurden. Diese Daten zeigen, dass das isolierte Protein von jeder Probe immunreaktiv ist damit das Auslösen einer positiven Resonanz. PCR-Amplifikation (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde auf die Protein-Proben durchgeführt, um zu zeigen, dass das isolierte Protein-Fraktion frei von kontaminierenden Nukleinsäuren war. Die Ergebnisse für diese Experimente waren alle durch Gelelektrophorese negativ. Daraus schließen wir, dass der Proteingehalt der Probe von kontaminierenden Nukleinsäuren wurde abgetrennt. Diese Ergebnisse, im Ganzen mit denen für die Nukleinsäure-Isolierung Schritt zeigen, dass die Nukleinsäuren-und Protein-Gehalt in separaten Fraktionierung Schritte werden beschrieben isoliert genommen. t "> Beispiel 3:. Das isolierte Protein geeignet ist für die Elektrophorese 10 Abbildung 5 zeigt eine Coomassie gefärbt 8% Acrylamid-Gel mit BSA (5, Spuren A und C) und BSA geladen aus 6 M Guanidin-Isothiocyanat-Extraktion unter Verwendung der Pipette und zugehörigen isoliert Protokoll. Die elektrophoretische Mobilität des isolierten Proteins ist identisch mit der Kontrollproben. Wir schließen daraus, dass das Extraktionsverfahren ändert nichts an der kovalenten Struktur des isolierten Proteins. Abbildung 1, Teil A: Darstellung eines typischen Nukleinsäure Extraktionsverfahren Die Probe wird mit 6 M Guanidin-Thiocyanat in das Probenröhrchen vermischt und in den Sorbens fünfmal.. Nach dem letzten Durchgang, wird die Probe auf der Protein-Puffer zugegeben. Die Sorptionsmittel und gebundenen Nukleinsäuren werden zweimal mit Ethanol gewaschen. Die Probe wird dann Luft dRied und eluiert aus dem Sorbens. Abbildung 1, Teil B: Darstellung eines typischen Protein-Extraktions-Verfahren wird die Probe mit Proteinisolierung Puffer aus Schritt 1, Abbildung 1, Abbildung A über das Sorbens von einer zweiten Extraktion Pipette 15 Mal übergeben wird gemischt.. Der Rest des Verfahrens ist identisch mit der Nukleinsäure-Extraktion-Protokoll. 2:. Negatives Bild eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel Multiplexsignal Shiga-Toxin 1 und 2-Gen-Amplifikation wurde unter Verwendung Kulturproben (Bahnen A und B) oder Rohabwasser Proben mit E. versetzt coli O157: H7 (Spuren D, E und F). Die Proben wurden entweder direkt an ein PCR-Gefäß (Bahnen A und D) oder den Proben zugegeben wurden unter Verwendung der Isolation-Verarbeis und die extrahierten Nukleinsäuren wurden zur PCR-Reaktionsgefäß (Proben B, E und F) zugegeben. Das PCR-Protokoll ist eine Modifikation des einen von Feng et al 11 beschrieben. Unsere Modifikation nur die von der STX-1 (unteres Band) und stx 2 (oberes Band) Primerpaare amplifiziert gezielten Ausstieg aus alle anderen Primerpaare. Lane C ist die 1 Kb Leiter von BioRad. Abbildung 3: UV-Spektroskopie Ergebnisse von E. coli O157: H7 Nukleinsäuren isoliert mit der Extraktion berichtet Pipette Die isolierten Nukleinsäuren markiert sind, eine Trennung und Isolation. b. Das UV-Spektrum der Probe wurde auch vor Nukleinsäureextraktion getestet und markierten prä-Isolation. Die Spektren wurden unter Verwendung eines Hitachi U3010 Spektrophotometer und der zugehörigen Software-Paket. <br/>. Abbildung 4: Farbfoto von RapidChek Teststreifen Der Proteingehalt der Proben in Abbildung 2 verwendet wurde unter Verwendung des Pipetten-Extraktion und getestet für Immun-Reaktivität von Lateral-Flow-Assay. AC Lanes sind unverarbeitete Kontrollen, das heißt, Zellkultur wird auf den Teststreifen wurde ohne Nukleinsäure oder ein Protein Extraktion zugegeben. Ein Lane ist E. coli BL21 DE3 pLysS als negative Kontrolle, Spuren B und C zeigen, E. coli O157: H7, die unbehandelt (B) oder mit Mitomycin C für 4 Stunden (C) behandelt worden war. Lanes D bis H zeigen die Ergebnisse der Addition der extrahierten Proteins auf die Lateral-Flow-Teststreifen. Lanes D und E wurden sondiert mit Proteinextrakt aus E. coli BL21 DE3 pLysS entweder ohne (D) oder mit Mitomycin C behandelt (E) als negative Kontrollen. Lanes FH zeigen die Ergebnisse, wenn das extrahierte Protein aus E. coli O157: H7 verwendet. Das Protein wurde von unbehandelten (F), oder 2 Stunde (G) oder 4 Stunden (H) Mitomycin C behandelten Kulturen extrahiert.Positive Ergebnisse produzieren eine doppelte rote Linie. Bild 5:. Fotografie eines mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE BSA wurde von der Lösung unter Verwendung der Extraktion Pipette und beschriebenen Protokollen isoliert. Lanes A und C sind Kontrollbahnen von 250 ug / ml und 500 pg / ml. Spuren B und D zeigen gewonnen BSA aus Lösungen, die die gleichen Konzentrationen wie ihre jeweiligen Steuerelemente.