Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse
Summary
Ein optimiertes Verfahren zur Neuralleiste abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen-aus fetalen Gewebe der Maus zu reinigen, wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Ausdruck von fluoreszierenden Reporter-Allele zu diskreten Populationen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren. Die Technik kann angewendet, um neuronale Subpopulationen während der Entwicklung oder von adulten Geweben zu isolieren.
Abstract
Bei der Entwicklung der Neuralleiste (NC)-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen wandern weg von dem Neuralrohr zu autonomen Ganglien in inneren Organen wie dem Darm und der unteren Harnwege zu bilden. Sowohl während der Entwicklung und im reifen Gewebe Diese Zellen sind oft weit im gesamten Gewebe verteilt, so dass die Isolierung von diskreten Populationen mit Methoden wie Laser-Capture-Mikrodissektion ist schwierig. Sie können jedoch direkt visualisiert durch Expression von fluoreszierenden Reporter regulatorischen Regionen von Neuronen-spezifischen Gene, wie Tyrosin-Hydroxylase (TH) angetrieben wird. Wir beschreiben ein Verfahren, um hohe Ausbeuten von lebensfähigen TH + neuronalen Vorläuferzellen aus der fötalen Maus viszeralen Geweben, einschließlich Darm und unteren Urogenitaltrakts (LUT), bezogen auf Dissoziation und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) optimiert.
Die Th-Gen kodiert für das geschwindigkeitsbestimmende Enzym für die Produktion von Katecholaminen. Magensaftresistente neuronalen Vorläuferzellen beginnen, während TH ausdrückenÝng ihrer Wanderung in der fetalen Darm 1 und TH ist auch in einer Untergruppe von Erwachsenen pelvinen Ganglien Neuronen 2-4. Der erste Auftritt dieser Linie und die Verteilung dieser Neuronen in anderen Aspekten der LUT und ihre Isolation ist nicht beschrieben worden. Neuronale Vorläuferzellen exprimiert TH kann leicht sichtbar gemacht durch die Expression von EGFP in Mäusen, die das Transgen-Konstrukt Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Wir abgebildet Ausdruck dieses Transgen in der fötalen Mäuse, die Verteilung der TH +-Zellen in den Entwicklungsländern LUT dokumentieren bei 15,5 Tage nach der Begattung (DPC), Benennung der Morgen des Plug-Erkennung als 0,5 DPC, und beobachtet, dass eine Teilmenge von neuronalen Vorläuferzellen in der Koaleszenz pelvinen Ganglien Express EGFP.
Um LUT TH + neuronalen Vorläuferzellen zu isolieren, optimierte Methoden, die wir ursprünglich verwendet wurden, um Neuralleiste Stammzellen aus fetalem Mausdarm 2-6 zu reinigen. Vorherige Bemühungen zur NC-derived Populationen angeführten isolierenVerdau mit einem Cocktail von Collagenase, Trypsin, um Zellsuspensionen für die Durchflusszytometrie zu erhalten. In unseren Händen diesen Methoden hergestellten Zellsuspensionen aus der LUT mit relativ geringen Rentabilität. Angesichts der ohnehin schon niedrige Inzidenz von neuronalen Vorläuferzellen im fetalen Gewebe LUT, machten wir uns um die Dissoziation Verfahren, so dass das Überleben der Zelle in den letzten distanziert erhöht werden würde optimieren. Wir festgestellt, dass sanfte Dissoziation in Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manuelle Filterung, Sortierung und Durchfluss bei niedrigem Druck konnten wir durchweg höhere Überlebensrate (> 70% der gesamten Zellen) mit anschließender Ausbeuten von neuronalen Vorläuferzellen ausreichend für Downstream-Analyse zu erzielen. Verfahren beschreiben wir können allgemein angewendet werden, um eine Vielzahl von neuronalen Populationen von entweder fötalen oder adulten Mausgeweben isolieren.
Protocol
Discussion
Maus-Reporter exprimieren fluoreszierenden Reporter sind eine immer stärkere Verbreitung über verschiedene Anstrengungen im murinen Genetik Gemeinde 1,8,9. Als ein Ergebnis die Dissoziation hier dargestellten Verfahren kann stark zur Isolierung von diskreten neuronalen Subtypen Neurotransmitter-Rezeptor oder Expressionsmuster von entweder fötalen oder adulten Geweben, aufgebracht werden. Während wir diese Methode auf Expression eines fluoreszierenden Reporter-Transgen Basis optimiert haben, kann es auch z…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Catherine Alford für Anregungen Zelldissoziationslösung Methoden und Kevin Weller, David Flaherty und der Bretagne Matlock danken für die Unterstützung in der Durchflusszytometrie Shared Resource an der Vanderbilt University Medical Center und Melissa A. Musser für künstlerische Unterstützung mit Illustrationen. Wir danken Dr.. Jack Mosher und Sean Morrison Beratung beim Einsatz Isolierung von neuronalen Vorläuferzellen. Der VMC Durchflusszytometrie Shared Resource wird von der Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) und der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus US-amerikanischen National Institutes of Health Zuschüsse DK064251, DK086594 und DK070219 unterstützt.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
References
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
