Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell
Summary
Die Generierung und Charakterisierung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit humanisierten Mäusen wird hier beschrieben. Menschliche Thymus-Gewebe und gentechnisch veränderten humanen hämatopoetischen Stammzellen in immungeschwächten Mäusen transplantiert. Hierdurch ergibt sich der Rekonstitution eines konstruierten menschliche Immunsystem so zur in vivo-Untersuchung von Anti-Tumor-Immunantwort.
Abstract
Kleine Tiermodelle wie Mäuse wurden ausgiebig genutzt, um menschliche Krankheiten zu untersuchen und neue therapeutische Interventionen zu entwickeln. Trotz der Fülle an Informationen aus diesen Studien führten die einzigartigen Eigenschaften von Maus-Immunität sowie der Spezies-Spezifität von Viruserkrankungen wie humanes Immundefizienz-Virus (HIV) für die Entwicklung von humanisierten Maus-Modellen. Die früheren Modelle betrifft die Verwendung von C. B 17 scid / SCID-Mäuse und die Transplantation von humanen fötalen Thymus und fötale Leber bezeichnet thy / liv (SCID-hu) 1, 2 oder adoptiven Transfer von menschlichem peripheren Blut Leukozyten (SCID-huPBL ) 3. Beide Modelle wurden hauptsächlich zur Untersuchung von HIV-Infektionen verwendet wird.
Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser beiden Modelle war das Fehlen einer stabilen Rekonstitution der menschlichen Immunzellen in der Peripherie, um ihnen eine weitere physiologisch relevanten Modell HIV-Erkrankung zu untersuchen. Zu diesem Zweck wird die BLT humeinblech Mausmodell entwickelt wurde. BLT steht für Knochenmark / Leber / Thymus. In diesem Modell, 6 bis 8 Wochen alten NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) immungeschwächten Mäusen erhalten die thy / liv Implantat im SCID-hu Mausmodell nur von einem zweiten menschlichen hämatopoietischen Stammzelltransplantation 4 folgen. Der Vorteil dieses Systems ist die vollständige Rekonstitution des menschlichen Immunsystems in die Peripherie. Dieses Modell wurde verwendet, um eine HIV-Infektion und Latenz 5-8 studieren.
Wir haben eine modifizierte Version dieses Modells, in denen wir genetisch humanen hämatopoetischen Stammzellen (HHSC) geändert, um die thy / liv Implantat durch Injektion von folgten transduzierten autologen HHSC 7, 9 konstruieren erzeugt. Dieser Ansatz führt zu der Erzeugung von genetisch veränderten Linien. Noch wichtiger ist, passten wir dieses System die Möglichkeit einer Erzeugung funktioneller zytotoxischen T-Zellen (CTL) Expression eines Melanom-spezifische T-Zell-Rezeptors zu untersuchen. Mit diesem Modell konnten wir die Funktionalität unserer transgenen CTL nutzen Live-Positronen-Emissions-Tomographie (PET) zur Rückbildung des Tumors (9) bestimmen zu beurteilen.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Prozess der Erzeugung dieser transgenen Mäusen und Beurteilung in vivo-Wirksamkeit mit Live-PET-Bildgebung beschreiben. Als Hinweis, da wir menschliche Gewebe und lentiviralen Vektoren zu verwenden, entsprechen unseren Einrichtungen auf CDC NIH Richtlinien für Biosafety Level 2 (BSL2) mit besonderen Vorsichtsmaßnahmen (BSL2 +). Darüber hinaus sind die NSG Mäusen stark geschwächtes Immunsystem so muss ihre Wohnung und die Wartung zu den höchsten Gesundheits-Standards (entsprechen http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die modifizierte BLT humanisierten Mausmodell mit in vivo PET-Bildgebung verbunden sind leistungsfähige Werkzeuge, um chronische Krankheiten zu studieren. Dieses System nimmt die BLT Mausmodell und Fortschritten, die sie über den begrenzten Spielraum für HIV-Forschung. Darüber hinaus ist es ein großes System, in dem wir verschiedene Gentherapieprotokollen sowie diagnostische Techniken untersucht werden können, bevor sie den klinischen Umgebung erreichen. Die letztere mit den niedrigen Kosten der Verwendun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Alvin Welch und Larry Pang für ihre technische Unterstützung danken. CIRM New Faculty Award RN2-00902-1; Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (NIH) award P50 CA086306 das California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Zuschüsse RC1-00149-1 und RS1-00.203-1 finanziert die Caltech-UCLA Joint Center for Translational Medicine, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697 die UCLA AIDS Institute, die CIRM Tools und Technology Award RT1-01.126, und die UC multicampus Research Program und Initiativen aus dem California Center for Antiviral Drug Discovery (Anzahl MRPI-143.226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
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