Un<em> In vitro</em> Co-infezione da modello per lo studio<em> Plasmodium falciparum</em>-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Nota: Esperimenti con HIV-1 e il Plasmodium falciparum devono essere eseguite nel corretto livello di biosicurezza laboratori (BSL2 per i parassiti, e BSL3 per l'HIV-1 e co-infezioni) e precauzione particolare deve essere posta nell'uso potenzialmente infetto sangue umano. 1. Le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) Purificazione (Basato su 8 e 9) Iniziare con sangue umano fresco da donatori sani (500 ml) trattati con anticoagulanti (eparina, citrato, destrosio citrato acido o destrosio citrato fosfato). Utilizzare priva di endotossina reagenti quando purificare e isolare PBMC e per tutto il resto del protocollo. Disinfettare la sacca di sangue, compreso il tubo, con il 70% di etanolo, tagliare il tubo e trasferire con cautela il sangue in un pallone T150. Preparare 16 provette con 15 ml di separazione Medio Linfociti (Ficoll) per tubo da 50 ml (assicurarsi che Ficoll ha raggiunto la temperatura ambiente).Cautela strato 30 ml di sangue fresco sulla parte superiore. Centrifugare a 400 xg per 30 min a 20 ° C con interrompe. Durante la centrifugazione, la preparazione 8 x 50 ml provette coniche con 25 ml di soluzione salina bilanciata di Hank temperatura ambiente (HBSS) per provetta. Trasferire accuratamente l'anello nuvoloso cella a livello di interfaccia (contiene PBMC) al tubo 50 ml contenente il HBSS (piscina 2 anelli cellulari per ogni tubo). Completa volumi fino a 50 ml con HBSS. Centrifugare a 150 xg per 15 min a 20 ° C con rotture sul. Durante la centrifugazione dell'anello cella nuvoloso, raccogliere lo strato giallo superiore dal punto Ficoll, piscina per il plasma per riempire un tubo da 50 ml. Inattivare il complemento nel plasma riscaldando il tubo da 50 ml a 56 ° C per 30 minuti e centrifuga 10 min a 1.800 x g. Mantenere il supernatante (contiene plasma autologo diluito che può essere utilizzato come mezzo integratore a passi successivi). Rimuovere con cura il supernatante e resuspend il pellet di cellule dal punto 1.7 in 25 ml di HBSS e piscina 2 pellets per tubo da 50 ml. Spin a 300 xg per 8 minuti a 20 ° C. Rimuovere il surnatante con cura e risospendere il pellet in 10 ml di HBSS e piscina in un tubo da 50 ml. Prelevare un 'aliquota, eseguire l'esclusione blu trypan per valutare la mortalità e poi contare PBMC. Completa il volume a 50 ml con HBSS e spin 10 min a 300 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in RPMI 1640 a 5×10 6 cellule / ml (si dovrebbe ottenere circa 400-500 x 10 6 PBMC da 500 ml di sangue). 2. I monociti-macrofagi derivati ​​(MDM) Differenziazione (Basato su 8 e 9) Seed circa 1,25 x 10 8 PBMC in 15 piatti cm con RPMI 1640 (25 ml / piatto). Lasciare cellule aderiscono per 1-2 ore a 37 ° C con 5% CO 2 atmosfera. Trasferire cellule non aderenti in un pallone nuovo e lavare con 15 ml piastra priva di endotossina PBS due volte (5min, 300 xg). Le cellule aderenti sono monociti isolati. Per consentire monociti isolate di fresco a differenziarsi in MDM, aggiungere 20 ml di terreno RPMI 1640 supplementato con 5% di plasma autologo (dal passaggio 1,8). Aggiungere umano ricombinante fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, 25 ng / ml) e soluzione di penicillina / streptomicina (PS, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina). Incubare per 2 giorni, modificare medie e incubare 2-3 giorni supplementari a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. Rimuovere vecchio mezzo e lavare con PBS privo di endotossine una volta, aggiungere la PBS delicatamente e aspirare immediatamente. Per staccare MDM completamente differenziate, cellule trattare con ~ 7 ml Accutase (Accutase, una miscela disponibile in commercio e attività di proteasi collagenolitica che consentono il distacco delle cellule dal piatto di plastica) per 15-20 minuti a 37 ° C in una CO 5% 2 atmosfera, cullare dolcemente a metà tempo. Aggiungere 3-5 ml di plasma autologo (dal punto 1.8) in ciascun piatto (per aiutare a proteggere le cellule, mentreraschiatura). Raschiare delicatamente le cellule facendo attenzione che media copre le cellule di tutti i tempi e di trasferimento / piscina in una provetta da 50 ml. Lavare le piastre con PBS privo di endotossine per recuperare le celle numero possibile. Spin 5 min a 200 xg, eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 5 ml di terreno di coltura MDM (RPMI 1640 supplementato con 10% complemento-inattivato Siero fetale bovino (IFB), PS, 25 mM HEPES) e cellule di conteggio (MDM resa generalmente 2-8% del totale PBMC). Nota: una aliquota di MDM potrebbero essere prese in questa fase di valutare la purezza della popolazione cellulare mediante citometria di flusso, di solito il 99% di MDM ottenuto espressa CD14. Seme 1×10 5 MDM in 600 pl di mezzo di coltura MDM per pozzetto in piastre da 24 pozzetti. Incubare per una notte a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera prima infezioni. 3. Produzione e quantificazione di HIV-1 Stocks virali Produrre azioni virali utilizzando fosfato di calcio transfezione in cellule HEK293T Folloala il protocollo di Fortin et al. dieci. Per ottenere virus singolo ciclo contenenti la luciferasi-codifica gene reporter, co-trasfezione cellule HEK293T sia con 20 pg di NL4.3 Luc + Env – R + e 10 pg di pHCMV-G, o 15 microgrammi di NL4.3 Luc + Env – R + e 15 microgrammi di pJRFL env. Uso 30 microgrammi di NL4.3 Luc + Env – R + per generare controllo della glicoproteina-carenti virus. Per il virus replicativa completamente, utilizzare 30 microgrammi di NL4.3Bal env. I vettori pHCMV-G e pJRFL env codificare le glicoproteine ​​del virus della stomatite vescicolare (VSV-G) e di un CXCR5-tropico HIV-1 (diverso NL4.3Bal env), rispettivamente. Ulteriori informazioni sui plasmidi possono essere ottenuti da 8. I plasmidi possono essere ottenute attraverso il NIH AIDS Research and Program Reference (NIAID, NIH). Quantificare tutti gli stock virali mediante ELISA per la proteina HIV-1 p24 del capside 11, E verificare il loro potenziale infettiva prima dell'uso. Valutiamo l'infettività delle nostre riserve di virus attraverso l'uso di TZM-bl cellule indicatrici 12. 4. Cultura di parassiti Plasmodium falciparum (Basato su 13) 4,1 cultura generale e la manutenzione dei parassiti Mantenere P. falciparum parassiti fase 3D7 asessuali di eritrociti umani (gruppo O +) ad un ematocrito del 4% in RPMI 1640 (tamponato con HEPES 25 mM e 25 mM NaHCO 3) supplementato con 0,5% (w / v) Albumax II, 25 pg / ml gentamicina e ipoxantina 370μM a 37 ° C in una miscela gassosa di ossigeno 1% / anidride carbonica 5% in azoto. Parassitemia può essere controllata facendo un velo di cultura e colorazione con una soluzione Giemsa 15%. Mantenere sempre un cellule non infettate globuli rossi (uRBC) piatto di coltura nelle stesse condizioni come parassiti da utilizzare come un controllo. Per ottenere Parasit fine stagees (trofozoiti / schizonti primi), sincronizzare i parassiti come segue: 4,2 Parasite sincronizzazione Al mattino, raccogliere la cultura parassita, spin 5 min a 300 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere le sfere in 5 volumi ematocrito con 5% (w / v), D-sorbitolo e incubare 5 min a 37 ° C. Spin 5 min a 300 x g, eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 30 ml di mezzo la cultura e la rimessa in incubatrice. Circa 8 ore dopo, ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.3 in modo da ottenere parassiti ben sincronizzati. Parassiti fase avanzata (trofozoiti / schizonti primi) può quindi essere raccolte la mattina seguente per eseguire l'esperimento. Prima di purificazione, eseguire la colorazione Giemsa per confermare la fase del ciclo di vita. 4.3 Plasmodium falciparum-globuli rossi infetti (iRBC) depurazione Sterilizzare il separatore VarioMacs (stand e magnete) con il 70% di etanolo e ppizzo sotto il cofano biologico. Fissare la valvola a tre vie a colonna in basso a CS. Tagliare la fine della protezione dell'ago plastica con la taglierina Miltenyi speciale e fissare l'ago al fondo rubinetto. Bloccare la colonna all'interno del magnete con attenzione. Rimuovere le bolle d'aria nella colonna iniettando lentamente 10 ml di terreno di coltura MDM con il kit-chiuso siringa avvitato sul lato sinistro del rubinetto. Lavare la colonna con circa 20 ml di terreno di coltura MDM. Harvest RBC dalla piastra di coltura, lavare una volta con 10 ml di mezzo MDM (300 xg, 5 min) e risospendere il pellet in 12 RBC terreno di coltura MDM ml. Aggiungere lentamente alla colonna e lasciare che il flusso di sospensione attraverso (solo le cellule infettate globuli rossi contenenti parassiti nel trofozoite o stage schizonte sarà trattenuto dal campo magnetico a causa della presenza di cristalli emozoina). Risciacquare una volta con 20 ml di mezzo e arrestare il flusso di liquido quando raggiunge il disco bianco sulla parte superiore della colonna. Rimuovere la colonna dal magnete e iRBC eluire in una provetta pulita sterile con 12 ml di terreno di coltura MDM. Macchia un'aliquota del iRBC recuperato ed eseguire la colorazione Giemsa per confermare la fase di ciclo di vita. Contare iRBC recuperato utilizzando un emocitometro (isolato RBC sono al 100% iRBC). Celle a pellet (300 xg, 5 min), eliminare il surnatante e trattare le cellule con 500 microlitri AB + fresca di siero umano (opsonizzazione passo 14). Incubare per 30 min a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. Risciacquare una volta con 10 ml di terreno di coltura MDM (300 x g, 5 minuti), e risospendere iRBC alla concentrazione desiderata. Di solito, un 10% di parassitemia 15 centimetri piatto di coltura dà circa ~ 0.5-1×10 8 iRBC ben sincronizzati. 5. L'esposizione di MDM di Plasmodium falciparum Per esporre la MDM di uRBC o iRBC, le cellule devono essere risospese in mezzo di coltura MDM per ottenere un rapporto di uRBC / iRBC: MDM di 75:1. In precedenzapreparate piastre da 24 pozzetti contenenti MDM, aggiungere volume appropriato sospensione RBC in ciascun pozzetto. Eseguire tutti gli esperimenti, in triplice copia. Incubare co-colture per 4 ore a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. Lavare le cellule con 600 microlitri di endotossina-free PBS 3 volte, aggiungere il PBS delicatamente e aspirare immediatamente. Per lisare il restante RBC, lavare i pozzetti aggiungendo 200 microlitri di acqua ghiacciata sterile per 20 sec e aspirato. Aggiungere 600 pl terreno di coltura MDM e incubare 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. 6. L'infezione di MDM con un replicativa completamente HIV-1 Per valutare l'effetto di P. falciparum sulla replicazione dell'HIV-1 in MDM, aggiungere, secondo lo schema illustrato in Figura 1A, 10 ng di p24 (in 300 pl di MDM media) del virus NL4.3Bal env nel caso pozzetti, aggiungere solo mezzo MDM in pozzetti di controllo . Incubare 2 ore a 37 ° C in 5% Di CO 2 nell'atmosfera. Lavare le cellule con PBS privo di endotossine 3 volte, aggiungere il PBS delicatamente e aspirare immediatamente. Aggiungere 600 microlitri di terreno MDM fresca per bene. Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. Al giorno 3, 6, 9 e 12 dopo l'inizio di infezione virale, raccolto 200 pl di ciascun supernatante, aggiungendo 200 pl di mezzo fresco MDM successivamente. Mantenere i surnatanti raccolti a -20 ° C per la quantificazione dei principali HIV-1 proteina del capside p24 mediante ELISA seguito Fortin et al. 10. 7. L'infezione di MDM con un singolo Luciferase Encoding Virus Cycle Per determinare l'impatto del parassita su HIV-1 espressione genica in MDM, aggiungere, secondo lo schema illustrato nella figura 1B, 10 ng p24 (in 300 pl di mezzo MDM) di una NL4.3 Luc + Env – R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env) o NL4.3 Luc +Env – R + virus nei pozzetti corrispondenti. Incubare 2 ore a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. Lavare le cellule con 600 microlitri di endotossina-free PBS 3 volte, aggiungere il PBS delicatamente e aspirare immediatamente. Aggiungere 600 microlitri di terreno MDM fresca per bene. Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 atmosfera. Rimuovere il supporto di 72 ore seguenti l'infezione e aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi 1X (fornita con il kit di analisi luciferasi). Lasciate che le cellule lisare a temperatura ambiente, con agitazione delicata. Conservare a -20 ° C. Scongelare la piastra e trasferire 40 microlitri di lisato ad una piastra a 96 pozzetti luminometro; aggiungere 100 ul di substrato luciferasi (fornita con il kit di analisi luciferasi) e misurare la luciferasi (luciferasi Firefly) attività in un luminometro seguendo le istruzioni del produttore. 8. Risultati rappresentativi Utilizzando il nostro modello di co-infezione, si dimostra che exposure di P. falciparum alla MDM diminuisce la loro suscettibilità alle infezione da HIV-1. Infatti, una diminuzione significativa (p <0,05; 2 ANOVA, giorno 12) per il rilascio di particelle virali, come misurato da HIV-1 p24 proteina del capside del supernatante, si osserva in MDM pretrattati con parassiti (Figura 2A). Questa osservazione è confermata in cellule infettate da virus che codificano un gene reporter luciferasi. MDM con infezione da virus di questo tipo si annidano sia esogena VSV-G o HIV-1 glicoproteine ​​conduce in modo significativo (p <0,05, di Student t-test) produzione di luciferasi meno in cellule esposte a P. falciparum (Figura 2B). È interessante notare che VSV-G-pseudotyped virus prodotto molto maggiore attività di luciferasi che le loro controparti JRFLenv: ciò è dovuto alla maggiore efficienza di infezione VSV-G particelle pseudotyped 15. Dato che parassita esposizione agli impatti MDM entrambi i tipi di virus, questo suggerisce che influisce in qualche passo ex gene viralepressione (Figura 2B). È inoltre importante ricordare che la vitalità cellulare non è stata influenzata dalla MDM esposizione alla iRBC (dati non mostrati), indicando che l'inibizione osservata è specifico e non causa di mortalità cellulare. Figura 1. A) schema di Piastra MDM di infezione con un virus replicativa pienamente Mock:. Cellule non infettate. uRBC: cellule esposte a infettate globuli rossi. iRBC: cellule esposte a Plasmodium falciparum-globuli rossi infetti. Bal: cellule infettate con NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3Bal env B) Schema Piastra per l'infezione da MDM con singolo ciclo di luciferasi virus Mock-encoding:. cellule non infettate. uRBC: cellule esposte a infettate globuli rossi. iRBC: le cellule esposte a Plasmodium falciparum-infected globuli rossi. Δenv: cellule infettate con NL4.3 Luc + Env – R + JRFL:. Cellule infettate con NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env). VSV-g: cellule infettate con NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-g) Δenv / uRBC:.. cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3 Luc Env +-R + Δenv / iRBC: le cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env – R + JRFL / uRBC: cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: le cellule esposte a uRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-G): vsv-g/iRBC. cellule esposte a iRBC e infettati con NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-g). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> Figura 2. . A) Effetto del Plasmodium falciparum in materia di HIV-1 la produzione virale in MDM MDM sono stati esposti a uRBC o iRBC con un rapporto 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) per 4 ore e ampiamente lavato. Le cellule sono state infettate con 10ng di NL4.3Bal p24 per 2 h env. Produzione virale è stata monitorata mediante ELISA per HIV-1 p24 in cellule privo supernatante a tempi diversi dopo l'infezione virale iniziale. Un esperimento rappresentativo è mostrato B) Effetto del Plasmodium falciparum in materia di HIV-1 la trascrizione virale in MDM MDM sono stati infettati con uRBC o iRBC con un rapporto 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). Le cellule sono state poi infettate con 10ng di p24 del virus a ciclo unico (sia NL4.3 Luc + Env – R +, NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env) o NL4.3 Luc + Env – R + (VSV- g)). Espressione della luciferasi è stata valutata in lisati cellulari 72 ore dopo l'infezione virale iniziale. Un esperimento rappresentativo viene mostrato.