Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay
Summary
De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.
Abstract
Cellulaire beweeglijkheid is een belangrijk biologisch proces voor zowel eencellige en meercellige organismen. Het is essentieel voor verplaatsing van eencelligen naar een bron van voedingsstoffen of weg van onjuiste wijze, en in meercellige organismen voor weefselontwikkeling, immune surveillance en wondheling, maar een paar rollen 1,2,3 noemen. Deregulering van dit proces kan leiden tot ernstige neurologische, cardiovasculaire en immunologische ziekten, evenals verergerd tumorvorming en verspreid 4,5. Moleculair hebben actine polymerisatie en receptor recycling aangetoond een belangrijke rol spelen bij het cellulaire extensions (lamellipodia), dat de voorwaartse beweging van de cel 6,7,8 rijden. Echter, veel biologische vragen over de migratie van cellen blijven onbeantwoord.
De centrale rol voor cellulaire motiliteit in de menselijke gezondheid en ziekte onderstreept het belang van het begrijpen van de specifieke mechanisms bij dit proces en maakt nauwkeurige methoden voor het evalueren celmotiliteit bijzonder belangrijk. Microscopen worden meestal gebruikt om de beweging van cellen te visualiseren. De cellen gaan nogal langzaam, waardoor de kwantitatieve meting van celmigratie een resource-vend proces dat dure camera's en software kwantitatieve tijd lapsed films beweeglijke cellen. Daarom is de mogelijkheid om een kwantitatieve meting van celmigratie die kosteneffectief, niet bewerkelijk en die gebruik gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur voeren is een grote behoefte aan veel onderzoekers.
De phagokinetic spoor motiliteit assay maakt gebruik van het vermogen van een bewegend cel gouddeeltjes zuiveren van de weg naar een meetbare spoor maken op een colloïdaal goud beklede glazen dekglaasje 9,10. Met het gebruik van vrij beschikbare software kunnen meerdere sporen worden geëvalueerd voor elke behandeling statistische vereisten bereiken. De assay kan worden gebruikt om te beoordelenmotiliteit van veel celtypen, zoals kankercellen 11,12, fibroblasten 9, neutrofielen 13, skeletspiercellen 14, keratinocyten 15, trofoblasten 16, 17 endotheelcellen en monocyten 10,18-22. Het protocol omvat het creëren van dia bekleed met goud nanodeeltjes (Au °) die worden gegenereerd door een vermindering van chloroauric acid (Au 3 +) door natriumcitraat. Deze methode is ontwikkeld door Turkevich et al.. In 1951 23 en verbeterd in de jaren 1970 door Frens et al.. 24,25. Als gevolg van deze chemische reductie stap gouddeeltjes (10-20 nm in diameter) precipiteren uit het reactiemengsel en kan worden toegepast op dekglaasjes, die dan klaar voor gebruik in cellulaire migratie analyse 9,26,27.
In het algemeen phagokinetic spoor beweeglijkheid assay is een snelle, kwantitatieve en eenvoudig meten van cellulaire motiliteit. Bovendienkan worden gebruikt als een eenvoudige high-throughput assay voor gebruik met celtypen die niet vatbaar zijn voor time-lapsed beeldvorming, evenals andere toepassingen afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker. Samen het vermogen om cellulaire motiliteit van meerdere celtypen kwantitatief te meten zonder dure microscopen en software samen met het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en chemicaliën, maken het phagokinetic spoor motiliteit assay een goede keuze voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van cellulaire motiliteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
De phagokinetic spoor beweeglijkheid test die in dit artikel is een eenvoudige en zeer effectieve methode voor de kwantitatieve analyse van cel migratie. Omdat meerdere celtypen kunnen worden geanalyseerd 9-17, deze werkwijze heeft het potentieel brede gebruik over meerdere disciplines. Het gebruik van colloïdaal goud beklede dekglaasjes maakt de meting van een trackgebied gewist door een bewegende cel. De test kan van het effect van verschillende stimuli (bijvoorbeeld groeifactoren, gezuiverd ECM l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (AI050677, HD-051998, en GM103433), een Malcolm Feist cardiovasculair onderzoek gemeenschap, en een American Heart Association predoctorale gemeenschap (10PRE4200007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Glass Coverslips (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. |
References
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
- Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
- Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
- Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).
- Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
- Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
- Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
- Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
- Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
- McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
- Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
- Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
- Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
- Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
- Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
- Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
- Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
- Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
- Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
- Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
- Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
- Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
- Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).
