Hastalık Patogenez Eğitim için Bir Araç Olarak Nöronlar içine Antikor Transfeksiyon
Summary
Etkileşimleri ve hücre içi bir ortam içinde antikorların varlığı ile ilgili moleküler mekanizmalar üzerinde etkisi incelemek için hızlı bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntem, bir lipid formülasyonu dayanan bir kovalent olmayan kompleks oluşumu kullanılarak canlı hücreler içine transfekte antikor içerir. Bu teknik, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürleri ve primer hücreler için uyarlanabilir.
Abstract
Antikorlar canlı sistemlerde meydana gelen çeşitli olaylar içine roman fikir edinmek için yeteneği sağlar. Hedef proteinlere yüksek oranda spesifik antikorlar üretmek için yeteneği ele alınması gereken çok hassas biyolojik soruları için izin verdi. Önemlisi, antikorlar sistemik lupus eritematozus (SLE), romatoid artrit (RA), paraneoplastik sendromlar, multipl skleroz (MS) ve insan T-lenfotropik virüsü tip 1 (HTLV-1) de dahil olmak üzere insan hastalıklarının bir dizi patogenezinde oylandı myelopati / tropikal spastik paraparezi (HAM / TSP) 1-9 ilişkilidir. Antikorları hastalığın soruşturma alanıdır ve veri antikorlar ve enflamasyon çeşitli intrasellüler moleküllerin sonuçlar arasındaki etkileşimler, hücresel mesajlaşma ve apoptoz 10 değişmiş olduğunu göstermektedir neden nasıl. MS HAM ve / TSP olan hastalarda hücre içi RNA bağlayıcı protein heterojen ribonuclear protein antikorları üretmek için gösterilmiştir A05-07 Ocak (hnRNP A1) 3, 9, 11. Son veriler içi nöronal ve yüzey antijenleri hem antikor patojenik 3, 5-9, 11 olduğunu göstermektedir. Böylece hücre içi antikor çalışması için izin veren bir prosedür: protein etkileşimleri hastalığı patogenezinde büyük fikir ödünç verirdim.
Genler genellikle birincil hücreler ve kültür hücre hatları transfekte edilir, hücre içine antikorların Ancak transfeksiyon antikor yapısı veya kötü transfeksiyon verimliliği 12 değiştirilmesi engellendi. Transfeksiyondan diğer yöntemler, katyonik lipozomlar (DOTAP / DOPE) ve destek polyethylenimines (PEI) göre antikor transfeksiyonu içerir; kontroller ile karşılaştırıldığında, 12 antikor transfeksiyon içinde bir on-kat azalmaya yol, her ikisi de. Bu çalışmada gerçekleştirilen yöntem katyonik lipid-aracılı yöntemler ile benzerdir ve yoluyla antikorları ile kovalent olmayan kompleks oluşturmak için bir lipid bazlı mekanizmasını kullanır elektrostatik ve hidrophobic etkileşimleri 13. Biz non-kovalent elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla antikor yakalama ve hücrelerin içinde onları sunma yeteneğine bir lipid formülasyonu Ab-deliverin reaktifi kullanılmıştır. Böylece kimyasal ve genetik bağlantıları canlı hücrelerin içine fonksiyonel antikorlar teslimatı için gerekli değildir. Protein etkileşimleri 9: Bu yöntem, bize çeşitli antikor proteini yerelleştirme deneyler, hem de hücre içi antikor moleküler sonuçlarının analiz izleme ve gerçekleştirmek için sağladı.
Bu protokol, biz hızla çoğaltıcı ve transfeksiyon verimliliği yüksek derecede nöron içine antikorlar transfekte nasıl gösterecektir. Örnek olarak, anti-hnRNP A1 ve anti-IgG antikorları kullanır. Transfeksiyon etkililiği, kolay ölçülmesi için biz Atto-550-NHS ve FITC-etiketli IgG ile etiketli anti-hnRNP A1 antikorları kullanılmıştır. Atto550 NHS yüksek moleküler absorbsiyon ve kuantum yi yeni bir etiketsaha. Uyarma kaynağı ve Atto550 için floresan filtreleri Cy3 (Örn. 556 Em. 578) benzer. Buna ek olarak, yüksek Atto550 fotostabilite sahiptir. FITC-etiketli IgG bu yöntem bağımlı boya çok yönlü ve olmadığını göstermek için bir kontrol olarak kullanıldı. Bu yaklaşım ve oluşturulan verilerin hedef antijenleri hücre içi antikorların insan hastalıklarının patogenezinde rolü olabileceği rolü anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Protocol
Discussion
Özel moleküller ve bunların ekspresyon hipotezi test etmek için, genler ve diğer vektörler genel olarak hücre içine transfekte edilir. Bu işlemin özgün yönü kolaylıkla hedef hücre içine transfekte etmek için antikorlar yeteneğidir. Biz beş ayrı deneylerde çiftleri her bu yöntemi uygulandı. Transfeksiyon verimliliği sonuçları tüm deneyler arasında benzer olarak bulundu. Önemli olarak, yöntem, antikor yapısı veya fonksiyonu değiştirmeden hücre içine antikorların giriş sağlar. Ayrıca…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Araştırma ve Geliştirme Dairesi, Tıbbi Araştırma Servisi, Gazi İşleri Bakanlığı tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma bir VA Liyakat İnceleme Ödülü (MCL) ve Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Multipl Skleroz Araştırma Fonu Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | |
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | |
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 |
| PBS | Ambion | 9626 |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | |
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful ‘passive transfer’ of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
