Antikörper Transfektion in Neuronen als Werkzeug zur Pathogenese der Erkrankung Studieren

Antikörper bieten die Möglichkeit, neue Einblicke in die verschiedenen Ereignisse in lebenden Systemen zu gewinnen. Die Fähigkeit, hochspezifische Antikörper zu produzieren Zielproteine ​​wurde für sehr präzise biologischer Fragestellungen gelassen adressiert werden. Wichtigerweise haben Antikörper in die Pathogenese einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, einschließlich systemischem Lupus erythematodes (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), paraneoplastischen Syndromen, Multiple Sklerose (MS) und menschlichen T-lymphotropen Virus Typ 1 (HTLV-1) in Verbindung gebracht assoziierte Myelopathie / tropische spastische Paraparese (HAM / TSP) ^1-9. Wie Krankheiten verursachen Antikörper ist ein Bereich der laufenden Untersuchung und Daten nahe, dass Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und verschiedene intrazelluläre Moleküle führt zu Entzündung, zellulärer verändert Messaging und Apoptose ^10. Es hat sich gezeigt, dass Patienten mit MS und HAM / TSP Autoantikörper produzieren, um die intrazelluläre RNA-Bindeprotein heterogenen ribonuclear Protein A1 (hnRNP A1) ^{3, 5-7, 9, 11.} Neuere Daten weisen darauf hin, dass Antikörper, sowohl Intra-neuronale und Oberflächenantigene pathogenen ^{3, 5-9, 11} sind. So ein Verfahren, das für die Untersuchung der intrazellulären Antikörpers ermöglicht: Protein Interaktionen würde großen Einblick in Krankheitsentstehung verleihen.

Gene häufig in primären Zellen und Zelllinien in Kultur transfiziert wurde jedoch Transfektion von Antikörpern in Zellen durch Änderung des Antikörpers Struktur oder schlechte Transfektionseffizienz ¹² behindert. Andere Transfektionsmethoden sind Antikörper Transfektion auf kationischen Liposomen (bestehend aus DOTAP / DOPE) und Polyethylenimine (PEI) bezogen, welche beide in einem Zehn-fache Abnahme der Antikörper Transfektion resultierte, verglichen mit Kontrollen ^12. Das Verfahren unserer Studie durchgeführt ähnelt kationische Lipid-vermittelte Methoden und verwendet eine Lipid-basierten Mechanismus zur nicht-kovalente Komplexe mit den Antikörpern zu bilden, durch elektrostatische und hydrophobic Wechselwirkungen ^13. Wir verwendeten Ab-deliverin Reagenz, das eine Lipidformulierung einfangen kann Antikörper durch nichtkovalente elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen und liefert sie innerhalb der Zellen ist. So chemischen und genetischen Kupplungen sind nicht notwendig für die Lieferung von funktionellen Antikörpern in lebenden Zellen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, führen verschiedene Antikörper Tracing und Proteinlokalisierung Versuche sowie die Analysen der molekularen Folgen von intrazellulären Antikörper: Protein Wechselwirkungen ^9.

In diesem Protokoll wird gezeigt, wie an Antikörper zu Neuronen transfizieren rasch, reproduzierbar und mit einem hohen Grad der Transfektionseffizienz. Als ein Beispiel verwenden wir anti-hnRNP A1 und Anti-IgG-Antikörpern. Für die einfache Quantifizierung der Transfektionseffizienz verwendet man Anti-Antikörper mit hnRNP A1 Atto-550-NHS und FITC-markierten-IgG markiert. Atto550 NHS ist ein neues Label mit hochmolekularen Absorption und Quanten-yield. Anregungsquelle und fluoreszierenden Filter für Atto550 ähneln Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Darüber hinaus hat Atto550 hohe Photostabilität. FITC-markiertes IgG wurden als Kontrolle verwendet, um anzuzeigen, dass dieses Verfahren vielseitig und nicht färben abhängig ist. Dieser Ansatz und die Daten, die erzeugt wird Verständnis der Rolle, dass Antikörper gegen Zielantigene intrazelluläre könnte in der Pathogenese von Erkrankungen des Menschen spielen, zu unterstützen.