Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

A. Benodigde materialen: zie tabel 1 (reagentia) voor de bereiding HBSS (P / S) 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% penicilline / streptomycine (opgeslagen in de koelkast bewaard op ijs). 20% BSA stock wordt in water en in porties verdeeld en bewaard bij -20 ° C. HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA uiteindelijke concentratie 0,3%) Islet medium: RPMI + 10% FBS + 1% glutamine + 1% penicilline / streptomycine Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque 4-0 Suture (McKesson): gesneden in 2 ¾ inch stukjes en opgeslagen in een 10 cm Petrischaal Instrumenten: Buig de tang van Fine Science Tools tot 90 °, en vijl langs de gekartelde tanden van alle drie paar van de tang. Het doel is om saai de tanden, niet om ze te verwijderen. Canule voor toediening van collagenase / protease mengsel: 27G ½ inch naald, 30 ½ inchnaald, PE50 leidingen gesneden in 12 inch stukken. Bestand beide naalden tot een gladde afgeronde einde dat geen scherpe randen heeft. Steek de 27G naald in het ene uiteinde van een 12 inch stuk PE50 leidingen. Verwijder de 30G naald uit de behuizing door het inslaan van de behuizing met een tang, het draaien van de behuizing ¼ draai per keer. Verwijder de naald met de tang uit de behuizing en plaats deze in het andere uiteinde van de buis PE50 onder een dissectie microscoop. Zorg ervoor dat u geen knikken in de slang als je de naald in de PE50 slang. De 27G naald is het einde dat u de spuit van collagenase hechten. Collagenase (CI zyme MA) en neutraal protease (CI zyme BP). Reconstitueer de TDE volgens de instructies van de fabrikant. Raadpleeg de veel specifieke Analysecertificaat om de enzymactiviteit concentratie te berekenen. Breng een totaal van 350.000 collageen afbrekende activiteit (CDA) eenheden van de gereconstitueerde collagenase en 100.000 neutraal protease eenheden van de reconstitdeeld BP Protease in een conische buis en verdund tot 15 ml totaal in HBSS (P / S) B. Stap-voor-stap protocol 1. De inflatie van de alvleesklier met collagenase / Protease Mengsel Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie, verzadigen de muis torso met 70% EtOH, open buikholte volledig uit anus te membraan met een dissectie schaar en pincet. Plaats de muis op het platform van een dissectie microscoop. Trek het caecum en colon ascendens uit en zet ze buiten het lichaam holte aan uw linkerhand. Zie figuur 1 voor een overzicht van de volgende stappen. Plaats de lobben van de lever tegen het membraan, en moet er blijven als de lichaamsholte ver genoeg geopend. Vind de leverslagader, poortader en galgang bundel die naar de lever door het vastgrijpen van de twaalfvingerige darm met gebogen tang. Met een paar gebogen forceps, handen onder de slagader, ader en kanaal bundle en trek een 2 ¾ inch stuk van 4-0 hechtdraad onder de slagader, ader, galgang en een keer bind het en trek deze strak zo dicht mogelijk bij de lever mogelijk te maken. Gebruik van twee paar gebogen forceps voorzichtig pak de duodenum en vindt de galbuis aan de twaalfvingerige darm in de papil. Gebruik een tang van de tang te porren door de alvleesklier en het bindweefsel vlak onder de galwegen in de buurt van de papil. Snel Poke uw pincet door het orgaan van een gat te maken en zet beide tangen van een tang door en pak nog eens 2 ¾ inch stuk van 4-0 hechtdraad door en bind het een keer en trek hem naar een kleine cirkel, maar trek dan niet strak. Ga naar de 90 ° forceps en de Superfine Vannas schaar. Met de 90 ° tang voorzichtig knijpen en trek de dunne darm tot de galwegen strak staat. Maak een horizontale snede over de papil met de schaar door steken de open schaar in de darm en dan snijden met een beweging. Probeer alleen one dwars door de papil zonder loskomen van de galwegen van de papil. Terwijl u de darm van de 90 ° forceps, de canule op te voegen in de galbuis aan de halve lengte van de galwegen, en trek de hechtdraad strak om de canule. Vul een 3 ml spuit met 2,0 ml collagenase / protease mengsel en injecteren in de canule langzaam en constant tempo. Na het opblazen van de alvleesklier is voltooid, verwijdert de canule uit galwegen en het gebruik van de gebogen tang en gebogen veer schaar om de opgeblazen alvleesklier te verwijderen door te beginnen bij de colon descendens en knippen het bindweefsel als je trek de darmen omhoog. Blijf de alvleesklier te verwijderen uit de darmen tot aan de galwegen, verwijder vervolgens de alvleesklier van de milt, dan is de maag en vervolgens van de ingewanden van de buikholte. Eindig het verwijderen van door knippen weg de hechtingen. Voeg de pancreas een 50 ml buis met 5 ml HBSS(P / S). Deze buis moet op ijs. Herhaal de procedure hierboven voor elk dier tot vier dieren. Voor een optimaal resultaat, dissociëren slechts vier pancreata in een keer. Typisch, terwijl de eerste vier in de 37 ° C waterbad we opgeblazen eens vier pancreata. 2. Pancreas Dissociatie Plaats de 50 ml buisjes met de pancreata in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Schud de buis en controleer weefsel dissociatie, lees dan zeker weefsel komt gemakkelijk uit elkaar, dan wervelen de buizen 12 keer terwijl u houden van de buis door het deksel. Voeg niet meer dan 30 ml HBSS (BSA) (dit kan een kleinere hoeveelheid zijn, afhankelijk van hoeveel moet de buizen balans voor de centrifugestap) en centrifugeer bij 290 xg gedurende een min. Zorgvuldig aspireren supernatant en laat een kleine hoeveelheid supernatant (2-3 ml) onder om zo niet de cel pellet te verstoren. Met behulp van een 30 ml spuit attached tot 14G naald, voeg niet meer dan 10 ml HBSS (BSA) en zuig de suspensie op en neer 2 keer. Filtreer het mengsel door een cel plastic theezeefje in een 50 ml buis en spoelen met nog eens 10 ml HBSS (BSA). Centrifugeer bij 330 xg gedurende 2 minuten. Decanteer supernatant en omkeren buizen uitlekken op een absorberende papieren handdoek gedurende 1 min. Resuspendeer elke buis in 10 ml koud 1100 Histopaque. Bedekken de Histopaque met 10 ml HBSS (BSA) en centrifugeer bij 900 xg gedurende 18 min. Verwijder de gehele 20 ml van de bovenstaande met behulp van een grote boring 25 ml pipet en laat de bovenstaande vloeistof op een omgekeerde 70 pm filter. Spoel de eilandjes in een 10 cm Petrischaal door pipetteren 10 ml eilandje media door het filter terwijl u hem rechtop over het gerecht. Cultuur de eilandjes in een 37 ° C, 5% CO2 weefselcultuurincubator tot aan experimenten. Typisch, worden eilandjes met de hand geplukt en voorafgaand aan de expertise geteldimentation. 3. Representatieve resultaten Islet opbrengsten, morfologie, en kwaliteit zijn de algemene parameters die worden gebruikt om het succes van eilandje isolatie te beoordelen. In onze handen eilandje opbrengst van de gemiddelde C57BL / 6 muis in het bereik van 150-250 eilandjes met dit protocol (zie tabel 2) en vergelijkbaar gegevens verkregen met geoptimaliseerde Sigma type XI collagenase. Echter kunnen de opbrengsten variëren afhankelijk van de gebruikte muizenstam en de leeftijd van de muis. De meeste dieren we gebruiken zijn in de week 8-16 leeftijd Dit protocol is getest op meerdere muizenstammen, waaronder C57BL / 6 (180-250 eilandjes / muis), CD1 (200-300 eilandjes / muis), 129 / B6 (200-300 eilandjes / muis), BLKS-db/db (120-200 eilandjes / muis), NOD (10 weken oud, 100-150 eilandjes / muis) en NOD-SCID (100-150 eilandjes / muis ). Typische eilandje morfologie weergegeven in figuur 2, waarin eilandjes een ronde vorm te langwerpig met relatief uniforme grootte (hoewel size uniformity kan variëren van stam tot) stam. Figuur 3 toont onze typische analyse van glucose-gestimuleerde insulinesecretie uit C57BL / 6 muizen die eilandjes met gezuiverd TDes vs Sigma type XI collagenase. Typisch een hoge kwaliteit eilandje preparaat resulteert in een insulinestimulatie bij 25 mM glucose die 6-20 maal groter dan waargenomen bij 2,5 mM glucose. Andere toepassingen kunnen ook worden gebruikt om de kwaliteit van geïsoleerde eilandjes testen en deze omvatten het gebruik van technieken perifusion, Ca 2 + imaging (met fura2) en reverse-transcriptie PCR, onder anderen 11. Figuur 1. Een samenvatting van de canulatie van de galwegen. Figuur 2. Typisch uiterlijk van C57BL / 6 eilandjes op 24 uur na isolatie. Beelden werden verkregen op een inomgezet microscoop bij 40X vergroting. Figuur 3. Glucose-gestimuleerde insuline secretie van C57BL / 6 eilandjes. Na 24 uur na isolatie werden 100 eilandjes geïncubeerd in een 12-well schaal 1 uur bij 37 ° C in Krebs-Ringer-HEPES gebufferde oplossing die 2,5 mM glucose. Eilandjes werden vervolgens overgebracht naar Krebs-Ringer HEPES bij 2,5 mM glucose tegen uur, waarna de supernatant werd verzameld voor insuline meting met een twee-site immuunkleuring enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Crystal Chem). Dezelfde eilandjes werden vervolgens overgebracht naar Krebs-Ringer-HEPES gebufferde oplossing die 25 mM glucose en insuline in het medium werd gemeten door ELISA na 1 uur incubatie.