La purificación del patógeno a partir de vacuolas<em> Legionella</em> Infectados por fagocitos
Summary
Este artículo describe un método para el aislamiento y purificación de intacta<em> Legionella</em> Que contienen vacuolas (LCV) de amebas y los macrófagos. El protocolo de dos pasos comprende enriquecimiento LCV por inmuno-separación magnética usando un anticuerpo contra un marcador bacteriano LCV y purificación adicional por centrifugación en gradiente de densidad.
Abstract
El patógeno oportunista Legionella pneumophila es una bacteria resistente a la ameba, que también se replica en los macrófagos alveolares por lo tanto causantes de la neumonía grave "Enfermedad de los Legionarios" 1. En los fagocitos protozoos y mamíferos, L. pneumophila emplea un mecanismo conservado para formar un procedimiento específico, la replicación permisiva del compartimiento, la "Legionella contiene vacuola" (LCV). La formación de vehículos comerciales requiere la bacteria icm / Dot sistema de secreción tipo IV (T4SS), que se transloca hasta 275 "efector" proteínas en las células huésped. Los efectores manipulan proteínas del huésped, así como los lípidos y comunicarse con secreción, organelos endosomal mitocondrial y 2-4.
La formación de los LCV representa un proceso complejo, robusto y redundante, lo que es difícil de entender de una manera reduccionista. Un enfoque integral es necesaria para comprender globalmente la formación de vehículos comerciales ligeros, incluyendo un análisis global de la trayectoriaacogida ogen las interacciones de los factores y su dinámica temporal y espacial. Como un primer paso hacia esta meta, vehículos comerciales intactas son purificados y analizados por la proteómica y la lipidómica.
La composición y la formación de agentes patógenos que contienen vacuolas ha sido investigado por el análisis proteómico mediante cromatografía líquida o 2-D electroforesis en gel acoplado a espectrometría de masas. Vacuolas aisladas, ya sea del suelo de la sociedad ameba Dictyostelium discoideum, o los fagocitos de mamíferos albergaba Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 o Salmonella spp Legionella. 10. Sin embargo, los protocolos de purificación empleadas en estos estudios son mucho tiempo y tedioso, ya que requieren microscopía electrónica por ejemplo, para analizar la morfología LCV, la integridad y la pureza. Además, estos protocolos no explotar las características específicas de la vacuola es patógeno pararichment.
El método que aquí se presenta supera estas limitaciones mediante el empleo de D. discoideum produciendo un marcador fluorescente de vehículos comerciales ligeros y por la orientación de la SIDC bacteriana proteína efectora, que selectivamente ancla a la membrana de vehículos comerciales ligeros de la unión a fosfatidilinositol 4-fosfato (PtdIns (4) P) 3,11. LCV están enriquecidos en un primer paso por inmuno-separación magnética usando un anticuerpo purificado por afinidad primaria contra SIDC y un anticuerpo secundario acoplado a perlas magnéticas, seguido en un segundo paso por una centrifugación en gradiente de densidad clásica Histodenz 12,13 (fig. 1) .
Un estudio del proteoma de vehículos comerciales aislados de D. discoideum reveló más de 560 proteínas de la célula huésped, incluidas las proteínas asociadas a vesículas fagocíticas, ER mitocondrias y aparato de Golgi, así como las GTPasas varios que no han sido implicados en la formación antes del 13 de LCV. LCV enriquecido y purificado con elprotocolo descrito aquí pueden ser analizadas por microscopía (inmunofluorescencia, microscopía electrónica), los métodos bioquímicos (Western blot) y los enfoques proteómicos o lipidomic.
Protocol
Discussion
En contraste con los métodos publicados anteriormente, este protocolo se basa en dos pasos, primero la separación de LCV por un enfoque inmuno-magnética, y en segundo lugar, la purificación de LCV por centrifugación en gradiente de densidad. El aislamiento LCV se pueden seguir fácilmente por microscopía de fluorescencia, cuando sea bacterias marcadas fluorescentemente y las células productoras de GFP o tinción de anticuerpos se utiliza. El protocolo se describe aquí es un sencillo, recto hacia adelante método…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en nuestro laboratorio fue apoyada por el Instituto Max von Pettenkofer, Ludwig-Maximilians de Munich, la Universidad, la Fundación Alemana de Investigación (DFG, HI 1511/3-1) y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Genómica Médica de infección" iniciativa ( 0315834C).
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