De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

PARTE A: High-throughput crescimento de culturas bacterianas. 1. As bactérias crescem durante a noite, em 2 ml de Meio autoindução Usando placas de 24 poços Esterilizar as placas de 24 poços por microondas. Inocular 1,5 ml de meio de auto-indução (Medium Overnight Express) com recém-cultivadas colônias de bactérias ou ações de glicerol congelados. Nós normalmente inocular três poços para cada mutante, com três colónias individuais clonados. Reservar seis poços para controlos positivos e negativos. Para os controlos positivos que crescem em três clones de tipo selvagem e para os controlos negativos que crescem dois clones que foram transformadas com um plasmídeo não expressar. Verificar para esterilização suficiente da placa, deixando uma cavidade em branco para o controlo do meio-only. Cultivar as células durante 18 horas a 37 ° C e agitação a 250 rpm. Usamos lac induzível BL21 (DE3) Rosetta 2 células. Meio de auto-indução contém uma mistura de glucose e lactose. A bactéria inicialmentealimentar de glucose e em seguida começar a utilizar a lactose, o qual também induz a expressão das proteínas recombinantes. Remover a tampa e colocar a placa na plataforma robótica. PARTE B: purificação de proteínas recombinantes Robótica. 2. Prepare a plataforma robótica Tornar-se o tampão de lavagem consistindo em 20 mM de imidazole, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, glicerol a 10%, e o tampão de eluição constituído de imidazol 0,5 M, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% de glicerol. Estas memórias intermédias será usado para lavar as esferas após as proteínas marcadas foram ligados a eles, ou para eluir as proteínas a partir dos grânulos, respectivamente. Tornar-se o diluente bacteriana (100 ml de água destilada, com 15 ul de reagente anti-espuma). Esta solução será usadapara fazer diluições das culturas bacterianas durante a noite para a densidade óptica (A600) medições. A presença de anti-espuma no diluente evita a formação de bolhas de ar que possam interferir com as medições de leitor de placa. O volume da solução de lise composta por reagente fastbreak 10x, 2 lysonase ul por cada amostra e 15 mM MgOAc 2. Fastbreak contém uma mistura de detergentes e sais que quebrar as paredes celulares de bactérias e facilitar a liberação de proteínas intracelulares. Lysonase é uma mistura patenteada de lisozima e uma nuclease. Lisozima auxilia na ruptura da parede celular e a nuclease digere os ácidos nucleicos bacterianos libertados. Opcional: Faça-se uma solução de cloridrato de 6 M de guanidina. Algumas proteínas recombinantes tendem a ficar com as agulhas com teflon de pipetagem. A guanidina desnatura as proteínas e solução de cloridrato de lava-los de forma mais eficaz do que a água que é rotineiramente usado para lavar as laváveis ​​robóticos dicas de pipetagem após cada ªep. Prepare o BCA (ácido bicinconínico) reagente quantificação de proteínas por mistura de solução de ácido bicinconínico (reagente A) e da solução de sulfato de cobre (reagente B): ligações peptídicas reduzir Cu 2 + a partir do CuSO4 componente presente no reagente BCA de Cu em que 1 + a quantidade de Cu + 1 é proporcional ao número de ligações peptídicas presentes na solução. Num segundo passo, duas moléculas de ácido bicinconínico quelato de Cu 1 + resultando numa mudança de absorvância a 562 nm, o que resulta numa cor púrpura. A reação de cor é dependente do tempo e, geralmente, precisa de várias horas para ser definitiva. Depois que a cor é estável durante várias horas. Preencha calhas ou placas do tamanho certo e colocá-los em suas posições pré-alocados na plataforma robótica. Coloque uma placa de 24 cavidades para os resíduos de cloridrato de guanidina, duas claras placas de 96 cavidades para a OD 600 e medições de absorvância e um azul placa de 96 poços para poe proteínas purificadas sobre as suas posições sobre a plataforma. Coloque uma placa de 96 deepwell no stand magnético. Diluir MagneHis Ni-partículas de proteínas que se ligam através da formação de quelatos com os seus His-Tag de 5 vezes em água destilada e enchê-los para a unidade de pérolas em agitação. Desligue o agitador para manter os grânulos em suspensão. Ligue a plataforma robótica e lave as agulhas de pipetagem por vários minutos para remover as bolhas de ar que, de outra forma interferir com a precisão de pipetagem. As agulhas reutilizáveis ​​pipetagem são lavadas entre os passos de pipetagem individuais. Alternativamente, pontas descartáveis ​​podem ser utilizados. Todos os passos subsequentes são realizadas roboticamente. O protocolo de robótica está disponível mediante pedido. 3. Crescimento das células é verificada por medição da OD600 10 ul da cultura durante a noite dilui-se em 90 ul de uma solução diluente. Medir a OD 600 para assegurar que as bactérias cresceram até densidades semelhantes(Figura 1). 4. As células são quebradas para liberar as proteínas e para permitir Bead vinculativo 100 ul de suspensão de Ni-esfera magnética é distribuído em cada cavidade de uma placa de 24 cavidades segundo. 900 uL de cada cultura em pequena escala bacteriano é transferido para a placa de 24 poços contendo os grânulos. Adicionar 100 ul da mistura fastbreak / lysonase 10x. A placa de 24 poços é transferido para a plataforma de agitação para agitação rápida (800 rpm) durante 30 min à temperatura ambiente. As paredes das células bacterianas são interrompidas por uma combinação de forças mecânicas e acção química e as proteínas produzidas de forma recombinante são libertados para a solução. Com tags sua afinidade imediatamente ligar as esferas paramagnéticas de níquel quelantes. 5. As esferas são lavadas Os lisados ​​de células contendo-os grânulos em suspensão magnética são transferidos para uma placa de 96 deepwell que é posicionado sobre um suporte com mhastes agnetic que deslizam entre os poços. As placas de 96 cavidades têm uma parte inferior em forma de cone largo, que facilita a remoção do sobrenadante. As cavidades podem conter volumes de até 2,1 ml, mas são preenchidos com volumes muito pequenos. Isto permite-nos realizar vigorosos passos agitação sem amostra de contaminação cruzada por salpicos. As pontas das pipetas são lavadas entre cada passos de pipetagem com 6 M de guanidina-HCl. Este passo é crucial para a depuração de TFIIB e outras proteínas "pegajosos", para evitar a contaminação cruzada. Com outras proteínas pode ser suficiente para enxaguar as agulhas extensivamente com água, entre os passos de pipetagem. As hastes magnéticas do suporte magnético atrair as esferas paramagnéticas, puxando-os para fora a partir dos centros dos poços e permitir que as agulhas de pipetagem livre acesso ao sobrenadante. O sobrenadante é descartado. 500 ul de tampão de lavagem é adicionado à placa de 24 poços e subsequentemente transferido para a placa de 96 poços e paraNsure a transferência completa dos grânulos. A placa de 24 cavidades é removido do agitador. Outra ul 500 de tampão de lavagem é adicionado directamente à placa de 96 poços, a placa foi transferida para o agitador e agitado vigorosamente durante 1 minuto. A placa é movida de volta para o suporte magnético e o tampão de lavagem descartada. Este passo é repetido mais duas vezes e o procedimento de lavagem é terminada através da remoção de quaisquer vestígios de tampão da placa. 6. Eluir as proteínas em tampão de eluição 100 ul de tampão de eluição é adicionado aos grânulos, a placa é movida para o agitador e agitado vigorosamente durante 30 min à temperatura ambiente. A placa é movida de volta para o agitador e o eluato contendo a proteína recombinante purificada, é transferida para uma nova placa. 7. Medir as concentrações das proteínas purificadas 190 ul de reagente BCA mistura é transferida para uma placa de 96 poços clara e 10 ul da protein solução adicionada. Após várias horas de incubação (normalmente 5-6 ou durante a noite), medir a absorvância e compará-lo com os padrões de BSA para determinar as concentrações de cada uma das preparações de proteína purificada (Figura 2). As proteínas purificadas podem agora ser usados ​​para aplicações a jusante, nas concentrações apropriadas (Figura 3). 8. Resultados representativos O protocolo de purificação oferece duas etapas de controlo de qualidade, exemplos dos quais são mostrados. Nós somos capazes de identificar e documentar os potenciais problemas na fase de crescimento bacteriano (Figura 1) e, mais tarde, mediante a avaliação dos rendimentos das proteínas purificadas (Figura 2). Nós normalmente purificar proteínas e testá-los em triplicado. Isto, em combinação com as duas etapas de controlo de qualidade, dá-nos a certeza de que qualquer variação foi observada nos nossos ensaios funcionais devem-se ao mutante phenotype (Figura 3) e não é causada por variações experimentais ou purificações falhadas. Os rendimentos obtidos variam tipicamente 50-200 ug e são mais do que suficientes para vários ensaios funcionais. Figura 1. Histograma das medições de OD de uma placa de 24 poços com culturas durante a noite. Três clones de seis TFIIB variantes mutantes, assim como do tipo selvagem TFIIB foram cultivadas. Dois clones que transportam um plasmídeo não expressar e um poço com meio apenas servem como controlos negativos. As medições de OD mostram que existem pequenas variações nas taxas de crescimento entre as diferentes culturas. Figura 2. Rendimentos proteicos obtidos a partir destas culturas, conforme determinado por um ensaio de BCA e confirmada por SDS-PAGE. Uma das variantes não é expresso em níveis elevados. Em comcombinação com a Figura 1, pode-se concluir que esta não era devida ao crescimento celular diferencial, mas, devido à expressão da proteína não ser induzido adequadamente. Figura 3. Resultado representativo de um ensaio de transcrição. Medimos a actividade de estimulação de variantes TFIIB sobre a produção de pequenas transcritos abortivos por RNAP. Aqui, os efeitos de estimulação de uma biblioteca completa de substituições de um único aminoácido de TFIIB resíduo K87 são mostrados. O elevado grau de reprodutibilidade é confirmada por pequenas taxas de erro. Um gel de exemplo mostrando o desempenho de três mutantes em relação ao tipo selvagem (wt), controlos negativos (NC) e tampão de eluição apenas controla é descrito abaixo.