Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

I. Preparazione dei reagenti Anticorpo selezione e la preparazione Identificare gli anticorpi da utilizzare nell'esperimento. Quattro anticorpi di cattura specifici: per il consumo umano TNF-alfa, sia monoclonale o policlonale, tutte le specie stesso host. Quattro gli anticorpi specifici di rilevazione: per il consumo umano TNF-alfa, sia modificato, biotinilato, o PE-coniugato. Un anticorpo conferma: PE-coniugato e specifico per le specie ospitano gli anticorpi di cattura. Ricostituire tutti gli anticorpi per le concentrazioni di lavoro consigliati dal produttore. Selezionare quattro fiale di bassa concentrazione di MagPlex microsfere (tallone) insiemi o regioni, per esempio, i codici Luminex-ID MC10012, MC10013-ID, MC10014-ID, e MC10015-ID. Accoppiamento Anticorpi anti MagPlex Microsfere, utilizzando l'anticorpo xMAP (ABC) Kit di accoppiamento Refer il manuale dell'utente AbC Kit (Part # 89-00002-00-319) per la procedura di accoppiamento completo. (Nota: fotosensibile microsfere devono essere protetti dalla luce, quando possibile.) Portare i reagenti nel kit AbC a temperatura ambiente ed etichette quattro provette con i numeri di regione di tallone selezionati per la reazione di accoppiamento. Trasferire il contenuto dei quattro fiale di perline MagPlex (1 ml ciascuno o 2,5 x 10 6 perle) nelle provette di reazione quattro etichettati. Lavare ciascuna delle serie di microsfere due volte in 500 pl di tampone di attivazione, come descritto nel kit AbC manuale. Attivare ogni insieme tallone con 480 pl di tampone di attivazione, 10 pl di solfo-NHS, e 10 pl di reagente EDC, secondo la procedura nel kit AbC manuale, e incubare per 20 minuti. (Nota:. Reagente EDC deve essere ricostituito in 250 pl di tampone di attivazione immediatamente prima di questa fase) Ripetere il passaggio precedente di lavaggio con l'ormai "attivato" microsfere un totale di three volte con 500 pl di tampone di attivazione, come descritto nel manuale AbC kit. Preparare quattro soluzioni separate, ciascuna contenente 7,5 mg (cioè 3 g / milioni di microsfere) di anticorpo di cattura in un tampone di attivazione. Aggiungere queste quattro soluzioni anticorpo di cattura alle loro rispettive provette, ogni provetta immediatamente vortice, ed incubare per due ore su un rotatore. Ripetere il passaggio precedente di lavaggio con l'ormai "accoppiati" microsfere un totale di tre volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio fornito con il kit ABC. Dopo la fase di lavaggio finale, aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio in ogni tubo di reazione per fornire una concentrazione finale stock di 5 milioni di anticorpi accoppiati a perle per millilitro. Vortex e sonicare le provette di reazione per disperdere le microsfere. NOTA: parzialmente immergendo il flacone chiuso microsfere in un pulitore ad ultrasuoni riempita con acqua deionizzata prevede sonicazione efficace per tutte le fasi di lavaggio. (Vedi tabella dei materiali per l'equipment dettagli). Conservare le perline accoppiate a 2-8 ° C e al riparo dalla luce fino al momento dell'uso. Enumerazione accoppiato Microsfere Contare il numero di microsfere recuperato dopo la reazione di accoppiamento utilizzando un contatore di cellule o emocitometro. Consultare il manuale d'uso dello strumento di conteggio per le adeguate istruzioni per farlo. Il recupero dalla reazione di accoppiamento è tipicamente oltre il 90%. Conferma di accoppiamento Conferma la reazione di accoppiamento è riuscita da preparare soluzioni di prova delle scorte accoppiate tallone per ogni insieme, con la concentrazione finale di 100 perline / microlitro nel tampone del saggio (PBS con 1% BSA). Preparare le diluizioni del ficoeritrina (PE-) marcato specie di anticorpi anti-IgG conferma a 4 mg / mL nel tampone del saggio. Aliquotare 50 microlitri di ciascuna soluzione di test in quattro pozzi di un fondo tondo, piastra a 96 pozzetti, per un totale di 16 pozzi. Quindi si aggiungono 50 μL di tampone del saggio in otto dei pozzetti, per misurare fondo, e 50 pl di anticorpo conferma diluita nelle restanti otto pozzetti. Mescolare delicatamente le reazioni pipettando su e giù diverse volte con una pipetta multicanale. Coprire la piastra, e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore piastra. Posizionare la piastra su un separatore piastra magnetica per 1-2 minuti per disegnare le perline di soluzione. Quindi, rimuovere il liquido dalla forza invertendo la piastra, mentre il separatore, per un contenitore degli scarti. Lavare ciascun pozzetto due volte aggiungendo 100 pl di tampone del saggio e rimuovendo il supernatante dalla piastra in modo simile utilizzando il separatore magnetico piastra. Risospendere le sfere in 100 microlitri di tampone per il test pipettando gentilmente su e giù per cinque volte con una pipetta multicanale. Analizzare su uno strumento Luminex xMAP, come lo strumento MAGPIX. L'intensità del segnale fluorescente di questa reazione è directly proporzionale alla quantità di proteina sulla superficie dei granuli, fornendo una valutazione rapida della quantità relativa di proteina accoppiato ai talloni. Accoppiamento biotina agli anticorpi non modificate per il rilevamento Se si utilizza anticorpi di rilevazione non modificati, biotinilato, questi anticorpi con il Thermo Fisher EZ-Link solfo-NHS-LC-Biotina Reattivo (Cat. No. PI-21335) e la procedura descritta nel foglietto illustrativo. Una volta biotinilato, gli anticorpi di rivelazione può essere successivamente streptavidina marcata con ficoeritrina (PE-SA) nel saggio (Passaggio III.6.) In modo che possano essere rilevati con l'analizzatore xMAP. II. Assay Setup Preparare una miscela iniziale di tutte le quattro serie di microsfere con l'aggiunta di 10 pl di ciascuno 0,96 ml di PBS con 1% BSA (tampone per il test. Vedi tabella materiali) per determinare quale è più efficace con il dosaggio xMAP. Preparare le soluzioni per il rilevamento di anticorpi da parte diluting ciascuna a 1 mg / mL nel tampone del saggio. Preparare la R & D Systems TNF-α standard di proteine ​​a 2000 pg / mL nel tampone del saggio. Diluire il Streptavidina-rPhycoerythrin (SA-PE) (a condizione @ 1 mg / mL) a 8 mg / mL nel tampone del saggio. III. Anticorpo Screening Aggiungere 50 pl di anticorpo accoppiato miscela di microsfere a ciascuno dei 16 pozzetti di fondo tondo Costar a 96 pozzetti per il saggio di screening. Aggiungere 50 microlitri di tampone del saggio a 8 dei 16 pozzetti, a fondo misurare. Aggiungere 50 pl di R & D Systems TNF-α standard (@ 2000 pg / mL) per gli altri 8 pozzetti, per misurare la risposta. Incubare per un'ora a temperatura ambiente, protetto dalla luce, agitando su un saggio agitatore. Aggiungere 50 pl di ciascuno dei quattro anticorpi di rivelazione di quattro pozzetti (due di fondo e due risposta) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce, agitando su una piastra di saggio shaker. Aggiungere 50 pl della SA-PE reagente per tutti i pozzetti ed incubare 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, agitando sul metodo del dosaggio tavola oscillante. Posizionare la piastra su un separatore piastra magnetica per un minuto e quindi rimuovere il liquido dalla forza invertendo la piastra. Aggiungere 100 pl tampone saggio a ciascuno dei 16 pozzetti, posizionare la piastra del separatore piastra magnetica per un minuto e quindi rimuovere il liquido dalla forza invertendo la piastra mentre sul separatore. Aggiungere 100 ul di tampone per il test a ciascuno dei 16 pozzetti e leggere il piatto con lo strumento Luminex MAGPIX; riferimento al manuale utente per il corretto funzionamento. Selezionare una coppia di anticorpi che soddisfa la potenza del segnale desiderata. IV. xMAP test funzionale Dopo aver selezionato il miglior anticorpo di cattura, diluire 100 pl di che l'anticorpo-coupled magazzino tallone (dal punto IB8) a 10 mL con tampone del saggio. Aggiungere 50 pl dile perline diluiti a 78 pozzetti di due CoStar fondo tondo piastre da 96 pozzetti. (2 x 78 pozzi piastre = 156 pozzetti) Ciascuna piastra verrà utilizzata per valutare le prestazioni di un anticorpo differente. Preparare una di 12 punti curva standard, a partire a 8000 pg / mL e termina a 4 pg / mL, con la R & D Systems TNF-α standard. Aggiungere sei 50 microlitri di ogni diluizione replicati per ciascuna delle piastre, più sei pozzetti con 50 microlitri di tampone del saggio ciascuna, come sfondo, per un totale di 78 pozzetti / piastra. Incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente, protetto dalla luce, agitando su un saggio agitatore. Aggiungere 50 pl di anticorpo di rilevamento primo a tutti i pozzetti 78 della prima piastra. Ripetere l'operazione per l'anticorpo secondo rilevamento sul secondo piatto. Incubare le piastre per 30 minuti, a temperatura ambiente, protetto dalla luce agitando su un saggio agitatore. Aggiungere il 50 pl della SA-PE reagente a tutti i pozzetti di ciascuna piastra. Covarele due piastre per 15 minuti, a temperatura ambiente, al riparo dalla luce mentre stringe in un saggio di agitatore. Posizionare le piastre su piastre separatori magnetici per un minuto, quindi rimuovere il liquido con forza invertendo la piastra mentre sul separatore. Aggiungere 100 pl di tampone del saggio a ciascuno dei 78 pozzetti sulle piastre, porre le piastre su piastre separatori magnetici per un minuto, quindi rimuovere il liquido dalla forza invertendo la piastra. Aggiungere 100 ul di tampone per il test a ciascuno dei 78 pozzi sui piatti e analizzare lo strumento MAGPIX, facendo riferimento al manuale utente per il corretto funzionamento. V. ELISA Seguendo le istruzioni fornite con la R & D Systems umana TNF-α/TNFSF1A DuoSet kit ELISA (R & D Part # DY210), misurare la risposta generata dallo standard fornito con la R & D kit. Ripetere il test ELISA altre tre volte, sostituendo il R & D sistemi di acquisizione e rilevamento antibodies con gli anticorpi degli altri fornitori. Per semplicità, le due anticorpi per venditore (ad esempio, anticorpo di cattura Millipore con anticorpo di rivelazione Millipore, anticorpo di cattura Abcam con anticorpo di rivelazione Abcam, ecc). Valutare ciascuna coppia indipendentemente, come richiesto dal formato ELISA, con ciascuno dei tre standard di TNF-a proteine. VI. Risultati rappresentativi Questo protocollo viene illustrato come un tipico ELISA può essere convertito alla piattaforma xMAP mentre utilizzando la capacità multiplex della tecnologia di ottimizzare rapidamente il dosaggio. Il ELISA utilizzato in questo esempio è stato il Tumor Necrosis Factor-alfa umano (TNF-α) DuoSet ELISA kit da R & D Systems (R & D Part # DY210). In aggiunta alla coppia anticorpo fornito nel kit, tre coppie anticorpo altri provenienti da fonti diverse (vedi tabella Materials) sono stati valutati simultaneamente utilizzando la piattaforma xMAP. Four degli anticorpi sono state designate come anticorpi di cattura e sono stati accoppiati a Concentrazione Microsfere MagPlex Low. Gli altri quattro anticorpi sono stati designati come anticorpi di rivelazione, tre dei quali sono stati acquistati come biotina-accoppiati e il quarto è stato biotinilato come descritto nel protocollo. Gli anticorpi di questo studio sono stati scelti in base alla disponibilità e per il venditore. Tuttavia, in impostazione pratica, gli anticorpi devono essere scelti in base alle preferenze del singolo utente e l'esperienza prestazioni passato con tale anticorpo. Sebbene, questo esperimento non verificare l'idoneità di un anticorpo come anticorpo di cattura rispetto anticorpo di rivelazione, questo protocollo può essere facilmente modificate a tale scopo. I saggi sono stati eseguiti xMAP Luminex come multiplex per valutare tutti gli anticorpi di cattura quattro come una miscela, combinando quattro serie di TNF-α anticorpo accoppiato MagPlex microsfere. Gli anticorpi di cattura sono stati valutati con ciascuno dei quattroGli anticorpi biotinilati rilevamento individualmente, in modo tale che l'interazione di un anticorpo rilevazione con ciascuna delle quattro anticorpi di cattura possono essere determinati simultaneamente. Quattro tali saggi, eseguite in parallelo, determinato le interazioni di tutti quattro gli anticorpi di rilevamento con i quattro anticorpi di cattura. Figura 1 mostra i dati comparativi da questi saggi di screening. I risultati hanno indicato che i due anticorpi dalla R & D Systems DuoSet i risultati migliori con una risposta conseguente al 6183 intensità di fluorescenza mediana (MFI) unità. E 'stato anche osservato che gli anticorpi di rilevazione da Millipore (86% della R & D risposta anticorpale coppia) e Abcam (67%) ha fornito una risposta ragionevole nel saggio xMAP, quando combinato con l'R & D di cattura degli anticorpi Systems. Gli anticorpi di cattura da Abcam, Millipore e Novus ha prodotto una risposta meno desiderabile nel saggio xMAP. È importante notare che il PURposa di questo studio non è necessariamente evidenziare le differenze tra particolari anticorpi o venditori, ma solo per illustrare che ci sono differenze osservabili nella loro prestazioni quando viene utilizzato in condizioni simili, e che la piattaforma xMAP in grado di offrire uno strumento efficace di valutazione di tali differenze. La R & D Systems DuoSet protocollo è stato utilizzato per confrontare le quattro coppie di anticorpi in un formato ELISA. La R & D Systems protocollo è stato utilizzato con tutte le coppie di anticorpi perché riflette tipici protocolli ELISA diffusi oggi ed è analogo a protocolli utilizzati con la tecnologia xMAP. I test ELISA hanno mostrato che la coppia anticorpo da R & D Systems nuovo dato i risultati migliori (Figura 2). La coppia di anticorpi da Abcam prodotto alcuna risposta e le coppie di anticorpi da Millipore e Novus risposte prodotte modeste. Per valutare ogni variazione reattività anticorpale alla norma, tutti e quattro anticorpicoppie y sono stati testati con tre differenti ricombinanti TNF-alfa standard proteine, da tre diversi fornitori (vedere la tabella dei materiali). I dati nella Figura 2 dimostrano che i ricombinanti standard di TNF-proteina dalla tre fornitori hanno dato risultati equivalenti. Il TNF-α proteina da R & D Systems è stato utilizzato per generare le curve standard con l'ELISA (Tabella 1) ed i saggi xMAP (Tabelle 2 e 3). Mentre il saggio ELISA è stato fatto con l'R & D anticorpi coppia Systems, i saggi xMAP utilizzato la R & S dei sistemi di cattura degli anticorpi e sia l'anticorpo di rilevazione da R & D Systems o Millipore. Il TNF-α proteina da R & D Systems è stata diluita per produrre una gamma di concentrazioni da 8000 a 4 pg / mL. Solo la coppia anticorpo da R & D Systems prodotto il risultato atteso nel dosaggio xMAP, con una risposta> 20.000 MFI, come mostrato nella Tabella 2 eFigura 3. Quando l'anticorpo di rivelazione da Millipore è stato utilizzato con il saggio xMAP al posto del R & D rilevazione di anticorpi Systems (Tabella 3), la risposta (6.000 MFI) era circa 30% della risposta ottenuta con l'anticorpo di rilevamento da R & D Systems, come mostrato nella Figura 3. I dati in Tabella 1 rappresenta la curva standard del ELISA, che aveva un consigliato dal produttore TNF-α gamma da 16 a 1000 pg / mL. Questa gamma è stata molto limitata perché l'OD a 1000 pg / mL era leggermente superiore a 2 unità OD e lo spettrofotometro è in grado di misurare oltre 3 OD. A causa del limite allo spettrofotometro, non è stato possibile aumentare la portata del saggio ELISA ulteriormente. Inoltre, i dati nella tabella 1 indicano che la R & D Systems DuoSet ELISA non è in grado di rilevare TNF-α a concentrazioni molto inferiori a 16 pg / mL. D'altra parte, il saggio xMAP è in grado di misurazionezione TNF-α ad una concentrazione inferiore a 7,8 pg / mL con l'anticorpo di cattura da R & D Systems combinati con l'anticorpo di rivelazione da entrambi R & D Systems o Millipore. La gamma dinamica e sensibilità di entrambi i metodi è meglio illustrato in fase di stampa in scala log-log (Figura 4). Una chiara distinzione tra la pendenza delle risposte ELISA e le risposte dei saggi xMAP può vedere che indica ulteriormente una capacità più limitante per il rilevamento di TNF-α con l'ELISA, sia a concentrazioni superiori e inferiori. I limiti di rilevabilità (LOD) per i due funzionali TNF-alfa saggi xMAP sono stati approssimati identificando la più bassa concentrazione di TNF-α con un livello di risposta osservata (MFI) superiore a fondo, più tre volte la sua deviazione standard (SD). Per raggiungere significatività statistica, sei duplicati sono stati utilizzati per determinare la SD per entrambi i metodi xMAP e ELISA. Thesstime elettronici di LOD sono ottimisti e destinato a fornire uno scenario "best-case", con l'intesa che in normali condizioni operative solo due o tre repliche verranno utilizzati. In Tabella 2, si osserva che, quando si utilizza il R & D coppia Systems, più basso il TNF-α concentrazione 3,91 pg / mL prodotto una risposta di 66 MFI, che è maggiore della risposta del fondo + 3SD, soddisfano questi criteri . Quando l'anticorpo di rilevamento Millipore è stato utilizzato con l'R & D anticorpo di cattura Systems (Tabella 3), il limite di rilevazione era inferiore a 7,81 pg / mL. In questo caso, il più basso secondo TNF-α concentrazione di prodotto accettabile una risposta del 17 MFI; superiori la risposta più basso del TNF-α concentrazione oltre tre volte la deviazione standard. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) Allo stesso modo, il limite di rilevamento per la R & D Systems DuoSet ELISA è stata stimata essere tra i 63 pg / mL e 31 pg / mL (Tabella 1). <p class = "jove_content"> Figura 1. L'intensità media di fluorescenza (MFI), della R & D Systems standard (@ 2000 pg / mL) per ogni possibile combinazione degli anticorpi di cattura quattro (accoppiato a quattro regioni microsfere diversi) e gli anticorpi di rilevazione quattro. Clicca qui per ingrandire figura . Figura 2. La densità ottica (OD) di tre differenti standard ricombinanti (@ 1000 pg / mL) per quattro cattura e combinazioni di coppie di rivelazione per l'anticorpo. Cattura e gli anticorpi di rilevazione sono stati arbitrariamente associato dal fornitore, per semplicità. Clicca qui per ingrandire la figura . <tdcolspan > R & D Systems DuoSet pg / mL OD Dev Std 3 SD 1000 2,084 0,035 2,187 500 1,328 0,038 1,441 250 0,787 0,025 0,863 125 0,476 0,026 0,554 63 0,304 0,023 0,374 31,3 0,212 0,025 0,287 15,6 0,167 <td> 0,026 0,244 0 0,118 0,021 0,182 Tabella 1 La densità ottica (OD) di 2-volte serie di diluizioni specificato dal R & D inserto Sistemi pacchetto DuoSet, per l'uso come una curva standard;. Compreso deviazione standard (SD) e il limite previsto di rilevazione (LOD), tra 31,3 pg / mL e 63 pg / mL. R & D Systems Capture and Detection Anticorpi pg / mL MFI Dev Std 3 SD 8000 20.320 463 </td> 21.707 4000 15.594 223 16.263 2000 11.098 79 11.336 1000 6985 160 7465 500 4149 80 4390 250 2233 30,0 2323 125 1199 43,8 1330 63 636 14,0 678 31,3 340 12,9 379 <strong> 15,6 183 5,9 201 7,8 103 2,2 109 3,9 66 2,4 73 0 11 0,8 13,8 Tabella 2 L'intensità media di fluorescenza (MFI) di una serie di diluizione standard misurata dalla tecnologia xMAP, utilizzando la coppia di anticorpi incluso con il R & D Systems DuoSet;. Tra deviazione standard (SD) e il limite previsto di rilevazione (LOD), a meno di 3,91 pg / mL. R & D Systems Capture Ab Ab Detection con Millipore pg / mL MFI <strong> Std Dev 3 SD 8000 5800 143 6229 4000 3881 120 4242 2000 2176 73 2396 1000 1138 32,1 1234 500 578 31,3 671 250 289 6,2 307 125 142 3,1 151 63 75 5,3 91 31,3 44 3,3 54 15,6 28 2,6 35,5 7,8 17 1,5 21,2 3,9 10 2,0 16,3 0 7 1,4 11,4 Tabella 3 L'intensità media di fluorescenza (MFI) di una serie di diluizione standard misurata dalla tecnologia xMAP, utilizzando la R & S, sistemi di acquisizione di anticorpi e la rilevazione EMD Millipore anticorpi;. Tra deviazione standard (SD) e il limite previsto di rilevazione (LOD), meno a 7,81 pg / mL. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4084/4084fig3.jpg"/> Figura 3. Le curve standard dei due saggi xMAP e l'R & D Systems DuoSet ELISA. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 4. Un confronto delle curve xMAP standard e la curva standard ELISA in una scala log-log. Clicca qui per ingrandire la figura .