转换到一个点阵仪XMAP含量，使用多重抗体筛查方法的捕获ELISA

一，试剂准备 抗体的选择和制备 确定要在实验中使用的抗体。 四捕获抗体：人肿瘤坏死因子-α单克隆或多克隆具体;所有相同的宿主物种。 四个抗体检测方法：具体的人肿瘤坏死因子-α或者未修改，生物素，或PE标记。 一个确认抗体：PE标记的和具体的捕获抗体的宿主物种。 重组抗体的制造商建议的工作浓度。 低浓度MagPlex微球（珠）套或地区选择四个小瓶，例如，Luminex液相部分号码MC10012-ID，MC10013-ID，MC10014编号，MC10015-ID。 耦合的抗体MagPlex微，使用的XMAP抗体（ABC）耦合套件 重新FER到完整的耦合过程（＃89-00002-00-319）ABC试剂盒的用户手册。 （注：光敏微球应避光尽可能。） 带来的ABC试剂盒的试剂室温和偶联反应珠地区选择的数字标签4个反应管。 MagPlex珠4瓶（1毫升或2.5×10 6珠）的内容转移到四个标记的反应管。 珠集清洗两次激活缓冲区，如ABC试剂盒说明书所述，在500μL。 激活每个珠子集激活的缓冲区，磺酸基NHS的10μL，10μL的EDC试剂480μL，按ABC试剂盒说明书的步骤，并孵育20分钟。 （注：EDC的试剂必须在250μL激活缓冲区，立即到这一步之前重组。） 与现在的“激活”微重复以前的洗涤步骤共苏氨酸500μL激活缓冲区EE倍，ABC试剂盒说明书中所述。 准备四个单独的解决方案，每片含7.5微克捕获抗体激活缓冲区（即3微克/万微）。 这四个捕获抗体解决方案添加到各自的反应管，涡每个试管，立即和孵化上肩的两个小时。 现在“耦合”微球的3倍，ABC试剂盒附带的洗涤缓冲液500μL总重复以前的清洗步骤。 最后的洗涤步骤后，每个反应管中加入500μL洗涤缓冲提供了500万每毫升抗体偶联珠最后的股票集中。涡和超声反应管分散微球。 注：部分淹没在充满纯水超声波清洗机的封闭微小瓶提供有效的超声所有洗涤步骤。 （见电子材料表quipment细节。） 加上珠储存在2-8℃，避光，直到需要。 枚举的耦合微 计算微球的耦合采用细胞计数或血球的反应后恢复。这样做适当的指导，参考计数仪的用户手册。从偶联反应的复苏通常是90％以上。 耦合确认 确认偶联反应是准备为每套测试解决方案，加上珠股票成功，缓冲液中的最后100珠/μL的浓度（以1％BSA的PBS）。准备在4微克/毫升缓冲液稀释藻红蛋白（PE – ）标记的抗种抗体确认抗体。 分装50μL，每到一个圆底，96孔板，共16口井，四口井的测试解决方案。然后加入50μ成井8 L的缓冲液，来衡量的背景下，与50μL稀释后确认抗体成八其余井。 移液器多通道移液器上下几次，轻轻搅拌反应。覆盖板，板振动筛上30分钟，在室温下孵育。 为1-2分钟的解决方案，绘制出的珠子放在一个磁板分隔板。然后，取出液体有力反相板，而分隔，多浪费插座。 洗每个两次加入100μL检测缓冲和消除上清从盘使用磁板分隔在一个类似的时尚。 重悬于100μL检测缓冲液中轻轻吹打向上和向下的五倍多通道移液器珠。 1点阵仪XMAP仪器，如MAGPIX仪器，分析。这种反应的荧光信号的强度是directlŸ比例的金额上的珠子表面的蛋白质，加上珠蛋白相对量提供了一个快速评估。 耦合生物素未修改抗体检测 如果使用未修改的检测抗体，这些抗体与赛默飞世尔EZ-LINK磺酸基NHS-LC-生物素试剂（货号PI-21335）和包装说明书中所述的程序biotinylate。一旦生物素，可以在以后被标记的抗体检测方法，使他们可以与XMAP分析仪检测与链霉亲和素，藻红蛋白检测（SA聚乙烯）（步骤三.6。）。 二。试验设置 10μL每增加1％的牛血清白蛋白（缓冲液。请参阅材料表），以确定哪些是最有效的与XMAP检测到0.96毫升的PBS准备的所有四个珠集的初始混合物。 DIL的准备检测抗体解决方案uting每1微克/毫升缓冲液。 准备于2000皮克/毫升缓冲液中的R＆D Systems的TNF-α蛋白标准。 至8微克/毫升缓冲液稀释链霉rPhycoerythrin的（SA聚乙烯）（提供1毫克/毫升）。 第三。抗体筛查 1 COSTAR圆底96盘筛选试验16口井，每年加入50μL抗体耦合的微球混合。 加入50μL检测缓冲液的16口井8，测量背景。 加入50μL的R＆D Systems的TNF-α的标准（2000皮克/毫升），其他8口井，测量响应。 在室温，避光，孵育一小时，而一个试验板振动筛震动。 加入50μL四个抗体检测的四口井（两个背景和两个反应）和孵育30分钟，在室温，避光，一个试验板沙晃动，而KER。 加入50μL的SA-PE试剂所有油井，室温孵育15分钟，由轻保护，而一个试验板振动筛震动。 将在一分钟的磁板分隔板，然后取出液体，有力地反转的板块。 加入100μL检测缓冲液的16口井，将磁板分隔板一分钟，然后取出液体而有力反相板分隔。 16口井，每年新增100μL检测缓冲和阅读的Luminex MAGPIX仪器板指到用户的正常操作手册。 选择一种抗体对，以满足您所需的信号强度。 四。 XMAP功能检测在选择最佳的捕获抗体，稀释100μL抗体偶联磁珠股票（从步骤IB8）10毫升缓冲液。 加入50μL78口井的两个合演轮底96孔板稀释珠。 （78井×2板= 156井），每块钢板将用于评估不同的检测抗体的性能。 准备12点的标准曲线，开始于8000 pg / mL和结束于4皮克/毫升，在R＆D Systems的TNF-α的标准。加入50μL检测缓冲液每6个50μL，每个稀释复制到每个板块，加上六口井，为背景，共有78口井/板。 板在室温，避光，孵育一小时，而一个试验板振动筛震动。 加入50μL的第一次检测抗体所有78口井的第一盘。重复第二盘的第二次检测抗体。 板块孵育30分钟，在室温，避光，而一个试验板振动筛震动，。 添加了SA-PE试剂50μL，每块板的所有油井。 孵化15分钟的两个板块，在室温，避光，而一个试验板振动筛震动。 放置在一分钟的磁板分隔板，然后取出液体而有力反相板分隔。 加入100μL检测缓冲板78井，放置在一分钟的磁板分隔板，然后取出液体，有力地反转的板块。 加入100μL检测缓冲板78井和上MAGPIX仪器分析，指的是用户的正常操作手册。 五，ELISA检测 R＆D系统的人力TNF-α/TNFSF1ADuoSet ELISA试剂盒（研发部＃DY210）中包含的指示，测量与研发套件提供的标准所产生的响应。重复三次，酶联免疫吸附试验替代的R＆D Systems的捕获和检测蚂蚁ibodies与其他厂商的抗体。为简单起见，对供应商的抗体（如微孔微孔检测抗体捕获抗体，Abcam Abcam检测抗体捕获抗体，等）。 评估每对独立，由ELISA格式的要求，与TNF-α蛋白的三个标准。 六。代表结果此协议表明了一个典型的酶联免疫吸附试验可转换的XMAP平台的同时利用多重的技术能力迅速优化检测。在这个例子中使用的酶联免疫吸附试验是人类肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的酶联免疫吸附试验，DuoSet从R＆D系统套件（研发部＃DY210）。 除了 ​​套件中提供的抗体对从不同来源（见材料表），三对其他抗体进行了评价，同时使用XMAP平台。火炭你的抗体被指定为捕获抗体和耦合到MagPlex低浓度微。其他四个抗体检测抗体被指定为三，其中购买生物素耦合第四，生物素，在“议定书”中所述。 这项研究的抗体被选为可用性和供应商的基础上。然而，在实际环境中，抗体应选择基于个人用户的偏好和过去的表现，抗体经验。虽然，这个实验并不作为捕获抗体与检测抗体测试抗体的适用性，可以很容易地修改此协议用于这一目的。 作为一个多元化作为一种​​混合物，以评估所有四个捕获抗体进行的Luminex XMAP检测的，结合四套肿瘤坏死因子-α抗体耦合MagPlex微。捕获抗体进行了评价与四个生物素化检测抗体单独四个捕获抗体，每一个检测抗体的相互作用等，可同时测定。等四个检测，并行执行，确定所有四个捕获抗体与所有四个检测抗体的相互作用。 图1显示了从这些筛选试验的比较数据。 结果表明，从R＆D系统DuoSet抗体对执行最好在6183位数的荧光强度（MFI）单位产生的响应。也有人指出，Millipore公司的R＆D抗体对响应（86％）和Abcam（67％）的抗体检测方法提供了一个合理的回应，在XMAP检测时的R＆D系统捕获抗体结合。 Abcam，Millipore公司和Novus公司的捕获抗体产生在XMAP法的反应不太理想。 重要的是要注意，该PUR这项研究的姿势不一定是突出特定抗体或供应商之间的差异，而只是为了说明，观察他们的表现有类似的条件下使用时的差异，并在XMAP平台可以提供评估这些差异的有效手段。 的R＆D系统DuoSet协议是用于在ELISA格式比较四种抗体对。在R＆D Systems的协议，因为它反射典型ELISA今天广泛使用的协议，并与所有的抗体对类似于使用xMAP技术的协议。酶联免疫吸附试验表明，从R＆D系统的抗体对再次给了最好的结果（ 图2）。 Abcam抗体对生产没有Millipore公司和Novus公司生产的适度反应和对抗体反应。 以评估抗体反应的变化，用任何标准所有四个antibod的Ÿ对三种不同的重组TNF-α蛋白标准进行，从三个不同的供应商（见材料表）。在图2显示的数据，重组肿瘤坏死因子-α蛋白标准，从三家厂商给了相同的结果。 从R＆D系统的肿瘤坏死因子-α蛋白被用于生成与酶联免疫吸附试验（ 见表1）和（ 表2及表3）XMAP检测标准曲线。而ELISA法的R＆D Systems的抗体对，XMAP检测利用从R＆D系统或Millipore公司的R＆D系统的捕获抗体和检测抗体。从R＆D系统的肿瘤坏死因子-α蛋白稀释到生产从8000到4皮克/毫升的浓度范围。只对R＆D系统的抗体产生的预期结果在XMAP法，以响应> 20,000小额信贷机构，如表2所示，图3。时，从微孔检测抗体被使用的地方的研发系统检测抗体（ 见表3），的响应（6000小额信贷机构）约30％的检测抗体从R＆D系统获得的答复XMAP含量;如图3。 表1中的数据代表的酶联免疫吸附试验，其中有制造商的建议TNF-α的范围16至1000皮克/毫升的标准曲线。这个范围是非常有限的，因为在1000 OD皮克/毫升比2外径单位和分光光度计是无法衡量上述3外径。因为分光光度计的限制，这是不可能的酶联免疫吸附试验的范围进一步增加。此外，在表1的数据表明，R＆D系统DuoSet酶联免疫吸附试验是不能够检测TNF-α的浓度远低于16皮克/毫升。另一方面，XMAP检测能力的衡量ING肿瘤坏死因子-α在无论是R＆D系统或微孔检测抗体结合的R＆D系统的捕获抗体浓度小于7.8皮克/毫升。 日志记录规模绘制（ 图4），更好地说明这两种方法的动态范围和灵敏度。从XMAP检测的ELISA反应和响应的斜率之间的明确区分可以看出，进一步表明为与ELISA检测TNF-α的浓度较高和较低的更多限制的能力。 近似​​确定最低的TNF-α的浓度，观察反应水平（MFI）比背景，加上三倍标准偏差（SD）两个功能肿瘤坏死因子-αXMAP检测检测限（LOD）的限制。为了达到统计学意义，6复制的XMAP和ELISA方法被用来确定的SD。 THESLOD的的é估计是乐观的，并打算与理解，在正常工作条件下，只有两个或三个复制将用于提供“最好的情况”的情景，。 表2中，它可以，使用的研发系统配对，在最低的肿瘤坏死因子-α在3.91浓 ​​度时，皮克/毫升产生66小额信贷机构，大于的背景+ 3SD的响应的响应，满足此条件。当微孔检测抗体的R＆D系统的捕获抗体（ 见表3），检出限为小于7.81皮克/毫升。在这种情况下，第二最低的TNF-α浓度产生17个小额信贷机构的可接受的响应;大于最低的肿瘤坏死因子-α浓度的响应加三倍的标准偏差。 （10 MFI + 3（2.4）= 16.29小额信贷机构），同样的R＆D系统DuoSet酶联免疫吸附试验，检测限估计为63 pg / mL和31皮克/毫升（ 见表1）。 <p class“jove_content”> 图1。的中位数的荧光强度的研发系统标准（@ 2000皮克/毫升）每天的4捕获抗体可能结合（加上4不同的微区）和“4检测抗体（MFI）。。 点击这里查看大弄清楚 。 图2。四个捕获和检测抗体对组合三种不同的重组标准（1000皮克/毫升）的光密度（OD值）。捕捉和抗体检测为简单起见，由供应商任意配对， 点击这里查看大图 。 <td跨度=“4”> 的R＆D Systems的DuoSet 皮克/毫升 外径 STD开发 +3的SD 1000 2.084 0.035 2.187 500 1.328 0.038 1.441 250 0.787 0.025 0.863 125 0.476 0.026 0.554 63 0.304 0.023 0.374 31.3 0.212 0.025 0.287 15.6 0.167 <td> 0.026 0.244 0 0.118 0.021 0.182 表1的光密度值（OD）的2倍稀释的研发系统DuoSet包插入，使用标准曲线指定系列;。包括标准偏差（SD）的和的检测估计限（LOD值），31.3 pg / mL和63皮克/毫升。 R＆D系统的捕获和抗体检测 皮克/毫升 小额信贷机构 STD开发 +3的SD 8000 20,320 463 </td> 21707 4000 15,594 223 16263 2000 11,098 79 11336 1000 6,985 160 7465 500 4149 80 4,390 250 2,233 30.0 2,323 125 1199 43.8 1330 63 636 14.0 678 31.3 340 12.9 379 <s阮富仲> 15.6 183 5.9 201 7.8 103 2.2 109 3.9 66 2.4 73 0 11 0.8 13.8 表2中位数的荧光强度（MFI）。1标准稀释xMAP技术测量系列，使用的抗体对包含的研发系统DuoSet;。包括标准偏差（SD）的和的检测估计限（LOD值），低于3.91皮克/毫升。 R＆D系统与微孔检测抗体的捕捉抗体 皮克/毫升 小额信贷机构 <strong>标准开发 +3的SD 8000 5800 143 6,229 4000 3,881 120 4,242 2000 2,176 73 2,396 1000 1138 32.1 1234 500 578 31.3 671 250 289 6.2 307 125 142 3.1 151 63 75 5.3 91 31.3 44 3.3 54 15.6 28 2.6 35.5 7.8 17 1.5 21.2 3.9 10 2.0 16.3 0 7 1.4 11.4 表3中位数的荧光强度（MFI）。1标准稀释xMAP技术测量系列，使用的研发系统捕获抗体，并在EMD的微孔检测抗体;。包括标准偏差（SD）的和的检测估计限（LOD值），少比7.81皮克/毫升。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/4084/4084fig3.jpg"/> 图3。两个XMAP实验和研发系统DuoSet ELISA的标准曲线。 点击这里查看大图 。 图4。一个XMAP标准曲线和日志记录规模ELISA标准曲线的比较。 点击这里查看大图 。