Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

I. Подготовка реагентов Выбор антител и подготовка Определение антител, которые будут использоваться в эксперименте. Четыре захвата антител: для конкретного человека TNF-альфа, или моноклональных или поликлональных, все того же вида хозяина. Четыре обнаружение антител: для конкретного человека TNF-альфа, либо без изменений, биотинилированного или PE-сопряженными. Один подтверждения антител: PE-сопряженными и специфичны для вида-хозяина захвата антител. Восстановить все антитела к рекомендованной производителем рабочей концентрации. Выберите четыре флакона с низкой концентрацией MagPlex микросфер (шарик) множеств или регионов, например, Luminex часть номеров MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, и MC10015-ID. Соединение Антитела к MagPlex микросфер с использованием антител Xmap (ABC) Сцепление комплект Повторнофер в Руководстве пользователя ABC Kit (Part # 89-00002-00-319) для полной сцепки. (Примечание: Фоточувствительные микросферы должны быть защищены от света, когда это возможно). Доведите реагенты в комплекте ABC до комнатной температуры и этикетка четыре трубки реакции с борта номера регион выбран для реакции сочетания. Передача содержимого из четырех флаконов MagPlex бисера (1 мл каждая, или 2,5 х 10 6 бусин) в четырех помечены труб реакции. Мыть каждый борта наборы дважды в 500 мкл буфера активации, как описано в ABC комплект руководства. Активация каждого шарика набор с 480 мкл активация буфера, 10 мкл сульфо-NHS, и 10 мкл реагента EDC, в соответствии с процедурой, описанной в ABC комплект руководство и инкубировать в течение 20 минут. (Примечание:. EDC реагентов должен быть воссоздан в 250 мкл буфера Активация непосредственно перед этим шагом) Повторите предыдущий шаг, промыть в настоящее время "активирована" микросфер в общей сложности ЧетEE Times со 500 мкл буфера активации, как описано в руководстве ABC комплект. Подготовьте четыре отдельных решений, каждый из которых содержит 7,5 мкг (например, 3 мкг / млн микросфер) захвата антител в активации буфера. Добавьте эти четыре решения антител захвата в свои трубы реакции, вихрь каждую пробирку сразу, и инкубировать в течение двух часов на ротатор. Повторите предыдущий шаг, промыть в настоящее время "в сочетании" микросфер в общей сложности три раза с 500 мкл промывочного буфера входит в комплект ABC. После того, как заключительный этап стирки, добавить 500 мкл промывочного буфера в каждую реакционную трубку для обеспечения конечной концентрации запасов 5000000 антител связью бисером на миллилитр. Vortex и разрушать ультразвуком реакционных труб для разгона микросферы. Примечание: частично погружаясь закрытом флаконе микросфер в ультразвуковой очиститель наполненный водой DI обеспечивает эффективную обработку ультразвуком для всех промывания. (См. материалы для электронной таблицыquipment детали). Хранить сочетании бисера при температуре 2-8 ° C в защищенном от света, пока это необходимо. Перечень связанной микросфер Подсчитайте количество микросфер восстановился после реакции сочетания с помощью счетчика ячейки или hemacytometer. Обратитесь к руководству пользователя считая инструмента для соответствующих инструкций для этого. Восстановление связи реакция, как правило, более 90%. Связь подтверждение Подтверждение связи реакция была успешной по подготовке теста решения связанных шарика запасов для каждого набора, с конечной концентрации 100 бусин / мкл в буфере для анализа (PBS с 1% BSA). Подготовить разведение фикоэритрин-(PE-) под названием анти-вид антител IgG подтверждение на 4 мкг / мл в буфере для анализа. Алиготе 50 мкл каждого теста решение на четыре лунки с круглым дном, 96-луночного планшета, в общей сложности 16 скважин. Затем добавить 50 μЛ буфером на восемь скважин, для измерения фона, и 50 мкл разбавленного антитела подтверждение в восьми оставшихся скважин. Смешать реакции осторожно с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз с многоканальным пипетки. Закройте планшет и инкубировать 30 минут при комнатной температуре на тарелке шейкер. Поместите пластину на магнитный сепаратор пластину в течение 1-2 минут, чтобы сделать бусы из раствора. Затем удалите жидкость насильственно обращения пластины, а на сепаратор, на отходы сосуд. Промыть каждую лунку в два раза путем добавления 100 мкл буфером и удаления надосадочной от пластины таким же образом с помощью магнитного сепаратора пластины. Ресуспендируют бусины в 100 мкл буфером, осторожно пипеткой вверх и вниз в пять раз с многоканальной пипетки. Анализ на приборе Luminex XMap, таких как инструмента MAGPIX. Интенсивность флуоресцентного сигнала этой реакции directlу пропорционально количеству белка на поверхности гранул, обеспечивающих оперативную оценку относительного количества белка связаны с бисером. Связь Биотин в Немодифицированные антитела для обнаружения При использовании немодифицированных антител обнаружения, biotinylate этих антител с Thermo Fisher EZ-Link сульфо-NHS-LC-биотин реагентов (№ ПИ-21335) и процедуру, описанную в листке-вкладыше. После биотинилированный, обнаружение антител в дальнейшем могут быть помечены стрептавидин фикоэритрин (SA-PE) в анализе (шаг III.6.), Так что они могут быть обнаружены с помощью анализатора Xmap. II. Анализ установки Подготовить исходную смесь всех четырех наборов шарика, добавляя 10 мкл каждого до 0,96 мл ФСБ с 1% BSA (буфером. См. материалы таблицы) для определения наиболее эффективных с Xmap анализа. Подготовка решений обнаружение антител к разбавленнойuting каждый 1 мкг / мл в буфере для анализа. Подготовка R & D Systems TNF-α белка стандарт в 2000 пг / мл в буфере для анализа. Развести стрептавидином rPhycoerythrin (SA-PE) (при условии, @ 1 мг / мл) до 8 мкг / мл в буфере для анализа. III. Скрининг антител Добавить 50 мкл антител связью микросфер смеси каждого из 16 скважин Costar круглым дном 96-луночный планшет для скрининге. Добавить 50 мкл буфером на 8 из 16 скважин, для измерения фона. Добавить 50 мкл R & D Systems TNF-α стандарт (@ 2000 пг / мл) в другие 8 скважин, для измерения реакции. Выдержите в течение одного часа при комнатной температуре, в защищенном от света, при встряхивании на шейкере анализа пластины. Добавить по 50 мкл каждого из четырех антител обнаружения четырех скважин (два справочных и два ответа) и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света, при встряхивании на анализ пластины шакег. Добавить 50 мкл SA-PE реагента в каждую лунку и инкубировать 15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте, при встряхивании на шейкере анализа пластины. Поместите пластину на магнитный сепаратор пластину в течение одной минуты, а затем удалить жидкость насильственно обращения пластины. Добавить 100 мкл аналитического буфера для каждого из 16 скважин, поместите пластину на магнитный сепаратор пластину в течение одной минуты, а затем удалить жидкость насильственно обращения пластины, а на сепараторе. Добавить 100 мкл буфером для каждого из 16 скважин и читать пластины с инструментом Luminex MAGPIX, ссылаясь на инструкции по эксплуатации для нормальной работы. Выберите антител пара, которая отвечает желаемого сигнала. IV. Анализ функциональных Xmap После выбора лучшего захвата антител, развести 100 мкл, что антитела, связанной акции шарик (от шага IB8) до 10 мл с буфером. Добавить 50 мклразбавленных бисером до 78 скважин из двух Costar круглым дном 96-луночный. (78 скважин х 2 = 156 пластин скважин) Каждая пластинка будет использоваться для оценки деятельности различных антител. Подготовка 12-точка стандартной кривой, начиная с 8000 пг / мл и заканчивая на 4 пг / мл, с R & D Systems TNF-α стандарта. Добавить шесть 50 мкл повторов каждого разведения каждой из пластин, плюс шесть скважин с 50 мкл буфером каждый, в качестве фона, в общей сложности 78 скважин / пластины. Инкубируйте пластины в течение одного часа при комнатной температуре, в защищенном от света, при встряхивании на шейкере анализа пластины. Добавить 50 мкл первого антител ко всем 78 скважин первой пластинки. Повторите эти действия для второго антител на второй пластине. Инкубируйте пластины в течение 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света при встряхивании на шейкере анализа пластины. Добавить 50 мкл SA-PE реагента во все лунки каждой пластины. Высиживатьдвумя пластинами в течение 15 минут при комнатной температуре, в защищенном от света при встряхивании на шейкере анализа пластины. Установите плиты на магнитные сепараторы пластин в течение одной минуты, а затем удалить жидкость насильственно обращения пластины, а на сепараторе. Добавить 100 мкл буфером для каждого из 78 скважин на пластинах; поместить пластины на магнитных сепараторах пластину в течение одной минуты, а затем удалить жидкость насильственно обращения пластины. Добавить 100 мкл буфером для каждого из 78 скважин на пластинках и анализа на приборе MAGPIX, обращаясь к руководству пользователя для нормальной работы. В. ИФА Следуя инструкциям в комплекте с R & D Systems человека TNF-α/TNFSF1A DuoSet ИФА (R & D Part # DY210), измерить отклик порожденных стандарту, предусмотренному в R & D комплект. Повторите тест ИФА еще три раза, подставляя R & D Systems захвата и обнаружения муравейibodies с антителами других производителей. Для простоты пары антител поставщика (например, Millipore захват антитела антител Millipore, Abcam захват антитела антител Abcam и т.д.). Оценка каждой паре отдельно, как того требует формат ИФА, с каждой из трех TNF-α стандартам белка. VI. Представитель Результаты Этот протокол демонстрирует типичную ИФА может быть преобразован в платформе Xmap при использовании мультиплексирования возможности технологии быстро оптимизировать анализа. ИФА используется в этом примере был прав некроза опухоли фактор альфа (TNF-α) DuoSet ИФА с R & D Systems (R & D Part # DY210). В дополнение к антител пара представлена ​​в комплекте, три другие пары антител из различных источников (см. материалы таблицу) оценивались одновременно, используя Xmap платформы. ФоУра антитела были обозначены как захват антител и были связаны с MagPlex Низкая концентрация микросфер. Остальные четыре антитела были обозначены как обнаружение антител, три из которых были приобретены как биотин связью и четвертый биотинилированный, как описано в протоколе. Антитела для этого исследования были выбраны в зависимости от наличия и продавца. Однако в практических условиях, антитела должны быть выбраны на основе предпочтений отдельных пользователей и прошлый опыт исполнения с антителом. Несмотря на то, что этот эксперимент не проверить пригодность антител, антител против захвата обнаружение антител, этот протокол может быть легко модифицирован для этой цели. Luminex Xmap анализы были проведены в мультиплексе для оценки всех четырех антител захвата в виде смеси, объединяя четыре комплекта TNF-α антител связанной MagPlex микросферы. Захват антител были оценены с каждой из четырехбиотинилированного антитела выявление индивидуально, таким образом, чтобы взаимодействие одного обнаружение антител с каждой из четырех антител захвата могут быть определены одновременно. Четыре таких анализов, выполняемых параллельно, определяется взаимодействием всех четырех антител обнаружения со всеми четырьмя антител захвата. На рисунке 1 показаны сравнительные данные из этих скрининга. Результаты показали, что антитела пары из R & D Systems DuoSet показала лучшие результаты с результатом реагирования на 6183 Медиана интенсивности флуоресценции (MFI) единиц. Было также отмечено, что обнаружение антител от Millipore (86% от R & D ответ пару антитела) и Abcam (67%), при условии разумного ответа в тесте Xmap в сочетании с R & D антител захвата системы. Захват антитела Abcam, Millipore и Novus производится менее желательно ответ в тесте Xmap. Важно отметить, что PURПоза это исследование не обязательно подчеркнуть различия между отдельными антител или поставщиков, а просто чтобы показать, что есть наблюдаемая различия в их производительности при работе в аналогичных условиях, и что платформа Xmap может предложить эффективный способ оценки этих различий. R & D Systems DuoSet протокол используется для сравнения четыре пары антител в ИФА. R & D Systems протокол был использован со всеми парами антитело, потому что это отражает типичные протоколы ИФА широко используется сегодня, и это аналогично используются протоколы технологии Xmap. ИФА тесты показали, что антитела пары из R & D Systems снова дала лучшие результаты (рис. 2). Антитела пара из Abcam не дали ответа и антител пар из Millipore и Novus производится скромный ответ. Для того чтобы оценить любые изменения реактивности антител со стандартными, все четыре антителу пары были протестированы с тремя различными рекомбинантный ФНО-α стандартам белка, из трех разных производителей (см. материалы таблицу). Данные на рисунке 2 показано, что рекомбинантный ФНО-α белка стандартам от трех поставщиков дало такие же результаты. ФНО-α белка из R & D Systems была использована для стандартных кривых с ИФА (табл. 1) и Xmap анализов (табл. 2 и 3). В то время как анализ ИФА было сделано с R & D пары антител Systems, Xmap анализов использовали R & D Systems антител захвата и либо обнаружение антител от R & D Systems или Millipore. ФНО-α белка из R & D Systems разводили для получения диапазоне концентраций от 8000 до 4 пг / мл. Только антитела пары из R & D Systems дали ожидаемых результатов в тесте Xmap с ответом> 20000 МФО, как показано в Таблице 2 иРисунок 3. При обнаружении антител от Millipore были использованы с Xmap Анализ на месте R & D антител системы (табл. 3), ответ (6000 МФО) составляла около 30% ответов, полученных с обнаружения антител от R & D Systems, как показано на Рисунок 3. Данные в таблице 1 представлена ​​стандартная кривая ИФА, который был рекомендован TNF-α ряд производителей от 16 до 1000 пг / мл. Этот диапазон был весьма ограничен, так как диаметр 1000 пг / мл была немного больше 2 единиц ОП и спектрофотометр не в состоянии измерить выше 3 ОД. Из-за предела спектрофотометр, не было возможности увеличить диапазон анализа ELISA дальше. Кроме того, данные в таблице 1, показывают, что R & D Systems DuoSet ИФА не способны обнаруживать TNF-α в концентрациях, значительно меньше, чем 16 пг / мл. С другой стороны, анализ Xmap способна измеренииING TNF-α в концентрации менее 7,8 пг / мл с захватом антитела из R & D Systems в сочетании с обнаружением антител либо R & D Systems или Millipore. Динамический диапазон и чувствительность обоих методов лучше проиллюстрировать, когда построены в логарифмическом масштабе (рис. 4). Четкое различие между наклоном ответы ИФА и ответы от Xmap анализов видно, что также указывает более жесткие ограничения способности к обнаружению TNF-α с ИФА, как на высших и низших концентрациях. Пределы обнаружения (LOD) для двух функциональных TNF-α анализов Xmap аппроксимировались выявления низкого TNF-α с концентрацией наблюдается реакция уровне (МФО) больше, чем фон, а также в три раза стандартное отклонение (SD). Для достижения статистической значимости, шесть репликации были использованы для определения SD для Xmap и ИФА. Фесэлектронная оценки детализации с оптимизмом и предназначен для обеспечения "лучшем случае" сценарий, при том понимании, что в нормальных условиях эксплуатации только два или три повторяет будет использоваться. В таблице 2, можно заметить, что при использовании R & D Systems пара, самая низкая TNF-α концентрации в 3,91 пг / мл производства ответ 66 МФО, что больше, чем ответов фона + 3SD, отвечающих этим критериям . Когда Millipore антител были использованы с R & D Systems Захват антител (табл. 3), предел обнаружения составляет менее 7,81 пг / мл. В этом случае, 2-й низкой TNF-α концентрации производства приемлемый ответ от 17 МФО, больше, чем ответов из самых низких TNF-α концентрация плюс три раза больше стандартного отклонения. (10 МФО + 3 (2,4) = 16,29 МФО) Аналогичным образом, предел обнаружения для R & D Systems DuoSet ИФА, по оценкам, от 63 пг / мл и 31 пг / мл (табл. 1). <p claсс = "jove_content"> Рисунок 1. Средняя интенсивность флуоресценции (МФО) в R & D Systems стандарта (@ 2000 пг / мл) для всех возможных комбинаций из четырех антител захвата (в сочетании с четырьмя различными регионами микросфер) и четырех антител обнаружения. Нажмите здесь, чтобы увеличить понять . Рисунок 2. Оптической плотности (ОП) из трех различных рекомбинантных стандартов (@ 1000 пг / мл) в течение четырех захвата и обнаружения антител комбинаций пар. Захват и обнаружение антител произвольно парных продавцом, для простоты. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . <tdОбъединения = "4"> R & D Systems DuoSet пг / мл OD Std Dev +3 SD 1000 2,084 0,035 2,187 500 1,328 0,038 1,441 250 0,787 0,025 0,863 125 0,476 0,026 0,554 63 0,304 0,023 0,374 31,3 0,212 0,025 0,287 15,6 0,167 <td> 0,026 0,244 0 0,118 0,021 0,182 Таблица 1 оптической плотности (ОП) в 2-кратном разведении ряд указанных в R & D Systems DuoSet листок-вкладыш, для использования в качестве стандартной кривой. Включая стандартное отклонение (SD) и оценивается предел обнаружения (LOD), между 31,3 пг / мл и 63 пг / мл. R & D Systems Capture и обнаружение антител пг / мл МФО Std Dev +3 SD 8000 20320 463 </tг> 21707 4000 15594 223 16263 2000 11098 79 11336 1000 6985 160 7465 500 4149 80 4390 250 2233 30,0 2323 125 1199 43,8 1330 63 636 14,0 678 31,3 340 12,9 379 <sЧонг> 15,6 183 5,9 201 7,8 103 2,2 109 3,9 66 2,4 73 0 11 0,8 13,8 Таблица 2 Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) из стандартной серии разведения измеряется технологии Xmap с использованием антител пара входит в R & D Systems DuoSet,. Включая стандартное отклонение (SD) и расчетный предел обнаружения (LOD), менее 3,91 пг / мл. R & D Systems Захват Ab с Millipore обнаружения Ab пг / мл МФО <strОнг> Std Dev +3 SD 8000 5800 143 6229 4000 3881 120 4242 2000 2176 73 2396 1000 1138 32,1 1234 500 578 31,3 671 250 289 6,2 307 125 142 3,1 151 63 75 5,3 91 31,3 44 3,3 54 15,6 28 2,6 35,5 7,8 17 1,5 21,2 3,9 10 2,0 16,3 0 7 1,4 11,4 Таблица 3 средней интенсивности флуоресценции (MFI) из стандартной серии разведения измеряется технологии Xmap с помощью R & D Systems антител захвата и обнаружения EMD Millipore антител,. Включая стандартное отклонение (SD) и расчетный предел обнаружения (LOD), менее чем 7,81 пг / мл. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/4084/4084fig3.jpg"/> Рисунок 3. Стандартных кривых двух Xmap анализов и R & D Systems DuoSet ELISA. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 4. Сравнение Xmap стандартных кривых и кривой ИФА стандарт в логарифмической шкале. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .