Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen
Summary
Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.
Abstract
Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Sie bilden einen wesentlichen Teil des angeborenen Immunsystems ein. Während der akuten Entzündung, Neutrophile sind die ersten Entzündungszellen an der Stelle der Verletzung zu migrieren. Rekrutierung von Neutrophilen an eine verletzte Stelle ist ein schrittweiser Prozess, der erste, Erweiterung der Blutgefäße, um den Blutfluss zu erhöhen beinhaltet, zweitens mikrovaskulären strukturellen Veränderungen und die Flucht von Plasmaproteinen aus der Blutbahn, drittens, Walzgut, Adhäsion und Transmigration der neutrophilen Granulozyten über die Endothel, und eine vierte Akkumulation von Neutrophilen an der Stelle der Verletzung 2,3. Eine Vielzahl von in vivo und in vitro-Methoden entwickelt hat, das Studium dieser Prozesse 4 ermöglichen. Diese Methode konzentriert sich auf die Transmigration neutrophiler über menschliche Endothelzellen.
Eine beliebte Methode zur Untersuchung der molekularen Vorgänge in neutrophilen Transmigration beteiligt nutzt menschliche neutrophils Interaktion mit primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) 5. Neutrophile isoliert wurde optisch an anderer Stelle 6 beschrieben, so wird dieser Artikel die Methode zur Isolierung von HUVEC zeigen. Wenn sie einmal isoliert und bis zur Konfluenz werden die aktivierten Endothelzellen, was zur Hochregulierung von Adhäsion und Aktivierung Moleküle. Zum Beispiel, Aktivierung von Endothelzellen mit Cytokinen wie TNF-α zu einer erhöhten E-Selectin und IL-8-Expression 7. E-Selektin vermittelt Abscheidung und-rollen von Neutrophilen und IL-8 vermittelt die Aktivierung und feste Adhäsion von Neutrophilen. Nach Adhäsion Neutrophilen transmigrieren. Transmigration kann paracellularly auftreten (durch Endothelzellverbindungen) oder transzellulär (durch die Endothelzellen selbst). In den meisten Fällen treten diese Wechselwirkungen unter Strömungsverhältnisse im Gefäßsystem 7,8 gefunden.
Die parallele Platte Flusskammer ist ein weit verbreitetes System, dass miMikrofone der hydrodynamische Schubspannungen in vivo gefunden und die Untersuchung der Rekrutierung von Neutrophilen unter Strömungsbedingungen in vitro 9,10. Mehrere Unternehmen produzieren parallele Platte Strömungskammern und haben jeweils Vor-und Nachteile. Wenn Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich ist, muss Glas oder einem optisch ähnlichen Polymer verwendet werden. Endothelzellen nicht so wachsen wie auf Glas.
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode zur Phasenkontrast-, DIC-und Fluoreszenz-Imaging von neutrophilen Transmigration mit einem geringen Volumen ibidi Kanal Rutsche aus einem Polymer, dass die rasche Adhäsion und das Wachstum von humanen Endothelzellen unterstützt und verfügt über optische Eigenschaften, die vergleichbar sind gemacht Glas. Bei diesem Verfahren wurden Endothelzellen wachsen und stimuliert einen ibidi μslide. Neutrophile wurden unter Strömungsbedingungen eingeführt und Transmigration beurteilt. Fluoreszenz-Imaging der Übergänge ein Echtzeit-Bestimmung des Ausmaßes der parazellulären gegenübertranszellulären Seelenwanderung.
Protocol
Discussion
Forscher haben routinemäßig Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten zur Rekrutierung von Neutrophilen und Seelenwanderung zu studieren. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, dermale mikrovaskuläre Endothelzellen 12, Leber sinusoidalen Endothelzellen 13 und Endothelzellen aus menschlichen Nabelvene 10 begrenzt. Unter ihnen HUVEC gewonnen großer Beliebtheit wegen ihrer relativen Einfachheit der Isolation und Verfügbarkeit. HUVEC sind eine starke In-vitr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Pina Colarusso und das Live Cell Imaging Facility für ihre Unterstützung bei der Bildgebung und Bildanalyse; Frau Lailey für ihre technische Hilfe; und Einheit 51 an den Ausläufern Hospital in Calgary, AB für die Bereitstellung von menschlichen Nabelschnur. Dr. KD Patel ist eine Alberta Innovates: Health Solutions Scientist. Diese Arbeit wurde durch einen Betriebskostenzuschuss von der kanadischen Institutes for Health Research und Ausrüstung und Infrastruktur Zuschüsse von der kanadischen Stiftung für Innovation und dem Alberta Behörde für Wissenschaft und Forschung unterstützt.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
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